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    電針對大鼠腎缺血再灌注損傷的療效及對腎組織中caspase-3表達(dá)的影響

    2014-04-18 03:23:50白紅梅張杰陳璐
    江蘇中醫(yī)藥 2014年1期
    關(guān)鍵詞:組織細(xì)胞陽性細(xì)胞電針

    白紅梅 張杰 陳璐

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇南京 210029)

    電針對大鼠腎缺血再灌注損傷的療效及對腎組織中caspase-3表達(dá)的影響

    白紅梅 張杰 陳璐

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇南京 210029)

    目的:探討電針治療對腎缺血再灌注大鼠腎功能及組織中Caspase-3表達(dá)的影響。方法:將30只清潔級健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(IRI組)和電針組,每組10只。采用右腎摘除,左腎腎蒂夾閉缺血45min后再灌注的方法制備動物模型。電針組于造模成功后給予電針腎俞和涌泉穴治療。各組均于術(shù)后24h采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr),觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變,TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡率和免疫組化檢測腎組織細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果:腎缺血再灌注后大鼠血清BUN和Scr明顯升高,腎組織切片顯示有明顯的病理改變,腎組織細(xì)胞凋亡率及Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)顯著升高。與缺血再灌注組比較,電針組大鼠BUN和Scr顯著下降,腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低,Caspase-3陽性細(xì)胞的IOD值顯著降低。結(jié)論:電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護(hù)作用,能夠抑制Caspase-3蛋白表達(dá),具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,該作用可能是電針對IRI后腎臟保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

    腎缺血再灌注損傷 電針 細(xì)胞凋亡 caspase-3表達(dá) 病理學(xué) 實(shí)驗(yàn)研究

    缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指缺血組織在重新獲得血供后,組織細(xì)胞損傷未見減輕反而加重的一種病理生理現(xiàn)象。研究表明,IRI可通過炎癥、活性氧、內(nèi)皮素和細(xì)胞凋亡等多種途徑導(dǎo)致腎損害,而細(xì)胞凋亡是缺血再灌注致腎損傷的重要環(huán)節(jié)之一。因此,抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,對IRI的防治具有重要的臨床意義。目前認(rèn)為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)依賴的細(xì)胞凋亡途徑在IRI誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用[1]。近年有研究表明,電針治療可下調(diào)Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá),進(jìn)而可抑制細(xì)胞凋亡[2]。針刺耳穴可以減少血管癡呆大鼠海馬齒狀回Caspase-3表達(dá),減少腦缺血缺氧所致的海馬齒狀回顆粒細(xì)胞死亡[3]。本研究旨在評價電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)作用和對IRI誘導(dǎo)的腎組織細(xì)胞Caspase-3活性表達(dá)、細(xì)胞凋亡等的影響以探討電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)機(jī)制及臨床應(yīng)用的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型制作將30只清潔級健康SD雄性大鼠(體重180~200g,江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供)隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(IRI組)和電針組,每組10只。參照文獻(xiàn)[4]的方法建立腎缺血再灌注損傷模型,方法如下:采用3.5%水合氯醛1mL/100g腹腔麻醉后,腹橫切口入腹腔,切除右腎,顯露左腎蒂,用無創(chuàng)傷血管夾夾閉左腎蒂45min,造成腎缺血,然后松開血管夾行再灌注。松開血管夾,數(shù)分鐘內(nèi)腎臟顏色由缺血時的暗紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈t色,表示腎缺血再灌注模型建立成功。IRI組與電針組大鼠上法造模,假手術(shù)組做常規(guī)暴露左腎手術(shù),不夾閉左腎蒂,45min后關(guān)腹。

    1.2 電針治療方法參照第4版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜,選取腎俞和涌泉穴,常規(guī)消毒后,用直徑為0.22mm,長13mm的毫針,刺入3mm左右,接通華佗牌SD-I型電子針療儀,留針30min,采用連續(xù)波,頻率為3Hz,強(qiáng)度以大鼠尾巴輕微顫動為度。

    1.3 檢測指標(biāo)及檢測方法

    1.3.1 血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)各組大鼠術(shù)后24h經(jīng)下腔靜脈取血2~3mL,檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)。

    1.3.2 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察取左腎中間部位0.5cm× 1cm大小,固定,脫水,包埋,5μm厚度切片,HE染色,400倍光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)的改變。

    1.3.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)測定細(xì)胞凋亡率腎組織標(biāo)本常規(guī)處理,切片,TUNEL染色,鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞。高倍鏡下觀察,對8個連續(xù)不重疊的視野中陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù))×100%。

    1.3.4 免疫組化檢測Caspase-3的表達(dá)光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)情況,每張切片隨機(jī)采集5個高倍視野(400×),采用美國Media Cybernetics公司專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus,檢測Caspase-3表達(dá)的平均光密度值(IOD),所有視野均在同一光強(qiáng)度下檢測。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較,IRI組和電針組大鼠BUN和Scr明顯升高(P<0.01);與IRI組比較,電針組大鼠BUN和肌酐Scr顯著下降(P<0.01)。見表1。

    表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量(±s)

    表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量(±s)

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與IRI組比較,#P<0.01。

    組別動物數(shù)BUN(mmol/L)假手術(shù)組Scr(μmol/L)1011.14±2.5536.1±3.1 1032.30±3.62*電針組1022.18±3.02*#62.3±3.1*#IRI組109.4±8.6*

    2.2 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察腎組織切片光鏡下顯示假手術(shù)組腎管細(xì)胞大致正常;IRI組大部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹,出現(xiàn)不同程度的變性與壞死,間質(zhì)有充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤;電針組腎小管病變減輕較為明顯,僅見部分腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹,少量變性與壞死,腎間質(zhì)無明顯改變及炎細(xì)胞浸潤(見圖1)。

    圖1 各組大鼠腎臟組織病理圖片(×400)

    2.3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果TUNEL陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈黃褐色,細(xì)胞質(zhì)無染色,位于腎小管上皮細(xì)胞,腎小球無表達(dá)(見圖2)。圖像分析后,結(jié)果見表2。缺血再灌注損傷后,與假手術(shù)組比較,IRI組和電針組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與IRI組比較,電針組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

    圖2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況(×400)

    2.4 Caspase-3蛋白表達(dá)檢測結(jié)果Caspase-3陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,細(xì)胞核無著色,圖中細(xì)胞核呈深藍(lán)色系蘇木素復(fù)染的結(jié)果(見圖3)。圖像分析后,結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比較,IRI組和電針組大鼠Caspase-3表達(dá)IOD值顯著升高(P<0.01);與IRI組比較,電針組大鼠Caspase-3表達(dá)IOD值顯著降低(P<0.01)。

    圖3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞Caspase-3表達(dá)圖(×400)

    表2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)IOD值比較(±s)

    表2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3表達(dá)IOD值比較(±s)

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與IRI組比較,#P<0.01。

    組別動物數(shù)凋亡率(%)假手術(shù)組IOD 103.98±1.472001±606 1051.38±7.92*電針組1028.39±7.80*#3538±840*#IRI組7681±870*

    3 討論

    腎臟為高灌注器官,對缺血及缺血后再灌注均較敏感,因此在腎移植、腎血管手術(shù)、體外碎石、休克復(fù)蘇后很容易發(fā)生腎臟缺血再灌注,是缺血性急性腎衰竭(acute renal failure,ARF)的重要損傷環(huán)節(jié),也是移植腎功能延遲恢復(fù)與慢性移植腎喪失功能的關(guān)鍵因素之一[5-6]。缺血如果能夠及時糾正,并且能夠盡可能避免或減少再灌注性損傷,腎功能可不受影響或很快恢復(fù)正常,但當(dāng)腎臟局部缺血不能在機(jī)體自身神經(jīng)體液等因素的調(diào)節(jié)下進(jìn)行有益的平衡時,該缺血和隨后的再灌注損傷可導(dǎo)致不正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞功能的異常,引發(fā)一系列凋亡事件和壞死。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注組織和器官損傷的重要途徑[7],而Caspase-3位于細(xì)胞凋亡的下游,是各種凋亡通路的必經(jīng)之路,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8]。

    經(jīng)絡(luò)學(xué)說研究人體經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的循環(huán)分布、生理功能、病理變化及其與臟腑相互關(guān)系,是中國古代醫(yī)學(xué)家們在長期實(shí)踐中,經(jīng)過對“針感”的傳導(dǎo)、俞穴療效的體表病理現(xiàn)象的推測與了解,生理知識總結(jié)而啟發(fā)創(chuàng)立出來的?!澳I俞”為腎的背俞穴,為腎臟氣輸注于背部的腧穴,具有補(bǔ)益腎氣的作用;“涌泉”穴為腎經(jīng)的井穴,具有益腎、滋陰的作用。二穴在臨床上為治療腎臟及相關(guān)疾病的常用穴,具有較好的臨床療效。有研究表明,電針“腎俞”穴可升高腎血流量[9]。

    本研究采用電針“腎俞”、“涌泉”兩穴治療缺血再灌注致腎損傷大鼠,結(jié)果表明經(jīng)電針組大鼠血清BUN和Scr顯著下降,腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低,Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)的IOD值顯著降低,提示電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護(hù)作用,其深入機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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    編輯:吳寧

    R245.97

    A

    1672-397X(2014)01-0073-02

    白紅梅(1965-),女,醫(yī)學(xué)士,主任醫(yī)師,麻醉學(xué)專業(yè)。1007gh@163.com

    2013-04-08

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