化肝通絡(luò)方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機(jī)制研究

宣佶 田耀洲 曹鵬 胡春萍 蔡雪婷 張偉

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.解放軍81醫(yī)院，江蘇南京 210002；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇南京 210028）

化肝通絡(luò)方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機(jī)制研究

宣佶1，2田耀洲1，3曹鵬3胡春萍3蔡雪婷3張偉3

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.解放軍81醫(yī)院，江蘇南京 210002；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇南京 210028）

目的：探討化肝通絡(luò)方對膽汁性肝硬化模型大鼠的抗纖維化作用及其機(jī)制。方法：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、熊去氧膽酸（UDCA）組和化肝通絡(luò)方高、中、低劑量組，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均利用結(jié)扎大鼠膽總管方法制造膽汁淤積肝硬化模型。于造模后第2周開始分別給藥，給藥4周后取大鼠血清測總膽紅素（T-Bil）、直接膽紅素（D-Bil）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等肝功能指標(biāo)，取部分肝臟行HE染色觀察肝臟病理形態(tài)變化，ELISA法測定血清α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1抗體（TIMP-1）、細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）的表達(dá)，免疫組化方法測定肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、信號傳導(dǎo)蛋白3（Smad3）、Smad7的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠T-Bil、D-Bil、ALT、AST等肝功能指標(biāo)均明顯升高，且血清中α-SMA、TIMP-1、ICAM-1高表達(dá)。模型組大鼠肝臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞活動及纖維組織增生等病理改變?；瓮ńj(luò)方各劑量組、UDCA組與模型組比較，各項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)均有明顯下降，肝組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)亦明顯下降，Smad7表達(dá)明顯升高。結(jié)論：化肝通絡(luò)方對膽汁性肝硬化模型大鼠具有明顯的抗纖維化作用，其機(jī)制可能與TGF-β/smad信號通路有關(guān)。

膽汁性肝硬化 化肝通絡(luò)方 肝功能 肝纖維化指標(biāo) 病理學(xué) 實(shí)驗(yàn)研究

膽汁性肝硬化分為繼發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC），前者由肝外膽管長期梗阻引起。PBC是一種慢性進(jìn)展性自身免疫病，因肝內(nèi)長期、持續(xù)性的膽汁淤積，引起肝臟纖維化、肝硬化并最終導(dǎo)致肝衰竭，其起病隱匿，早期常常無明顯癥狀，部分患者到已達(dá)肝功能失代償期時才就診，因而預(yù)后較差[1-2]。藥物治療方面熊去氧膽酸（UDCA）是目前公認(rèn)的對PBC具有確實(shí)療效的首選治療藥物，但迄今尚無特異性藥物，而UDCA也僅僅對部分患者有效[3]。田耀洲教授通過中醫(yī)辨證論治研究總結(jié)了中藥化肝通絡(luò)方，治療本病獲得了較好的療效。本研究擬對化肝通絡(luò)方的療效進(jìn)行科學(xué)評價，并探索其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑熊去氧膽酸（UDCA），Losan Pharma GmbH生產(chǎn)；化肝通絡(luò)方（藥物組成：人工牛黃0.1g、紅花15g、五靈脂15g、余甘子30g、印度獐牙菜15g、肉豆蔻10g、黃芪25g、木香10g、傘?；⒍?5g、芫荽果10g、沉香3g、石榴子20g、烈香杜鵑8g、冬葵果15g、甘草10g），由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供；血清α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）ELISA測定試劑盒，BioSource公司（Lot No20120709）；金屬蛋白酶組織抑制因子-1抗體（TIMP-1）ELISA測定試劑盒，R&D Systems China（Lot No291100）；細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1） ELISA測定試劑盒，R&D Systems China（Lot No295330）；抗TGF-β1、Smad3、Smad7多克隆抗體，Cell Signaling Technology。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD大鼠72只，全雄，體重（180±20）g，購于南京青龍山動物繁殖場，合格證號：SCXK（蘇）2010-0001。

1.3 主要儀器全自動生化分析儀：日本日立公司；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；自動放射免疫計數(shù)機(jī)：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)中佳公司；臺式高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司；電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；酶聯(lián)免疫檢測儀：Thermo公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模取72只大鼠標(biāo)號后，隨機(jī)分為假手術(shù)組12只與造模組60只。大鼠予10%水合氯醛溶液（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，沿腹正中線開腹，找到并暴露膽總管，假手術(shù)組僅分離膽總管后關(guān)腹，造模組在肝門部膽管周圍的近端結(jié)扎膽總管后，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3d注射青霉素40萬單位/只，正常喂養(yǎng)[4]。

將造模成功的60只膽汁性肝硬化模型大鼠隨機(jī)分為模型組、熊去氧膽酸（UDCA，58.3mg·kg-1·d-1）組和化肝通絡(luò)方高劑量（4.36g·kg-1·d-1）、中劑量（2.18g·kg-1·d-1）、低劑量（1.09g·kg-1·d-1）組，每組12只，并于第8天開始各組大鼠按10mL/kg的體積灌胃相應(yīng)藥物，1次/d，共7d。假手術(shù)組及模型組給等體積生理鹽水。于最后1次灌胃后24h處死各組大鼠測定相關(guān)指標(biāo)。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 肝功能按照南京建成生物工程研究所試劑盒的方法檢測總膽紅素（T-Bil）、直接膽紅素（D-Bil）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）及堿性磷酸酶（ALP）。

2.2.2 肝組織學(xué)觀察肝組織經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟切片，按常規(guī)方法行HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化。

2.2.3 血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1測定將檢測血清嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒操作步驟進(jìn)行，分別測定血清中α-SMA、TIMP-1、ICAM-1的含量。

2.2.4 肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGF-β1）、信號傳導(dǎo)蛋白3（Smad3）、Smad7的表達(dá)檢測免疫組化染色采用SP法，處死后的大鼠肝臟經(jīng)10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)抗原3.5min，待切片晾至室溫后滴加3%H2O2，37℃孵育15min，PBS洗3次，每次5min，滴加胰酶消化15min，PBS洗片3次，每次5min。分別滴加TGF-β1、Smad3、Smad7一抗工作液（工作液濃度分別為1∶100、1∶50，用PBS稀釋），4℃孵育過夜。次日取出切片，PBS洗片3次，每次5min；滴加二抗工作液，37℃孵育40min。蒸餾水洗2次，每次5min，用現(xiàn)配制的DAB溶液顯色10min，蘇木精襯染2min，分化、返藍(lán)各30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，計算機(jī)掃描分析蛋白的陽性數(shù)目、灰度值和相對光密度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 治療后各組大鼠血清肝功能指標(biāo)測定見表1。

3.2 各組大鼠肝臟組織HE染色病理形態(tài)假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝板排列整齊，個別結(jié)構(gòu)稍紊亂，以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列，肝細(xì)胞多邊形，漿豐富，核大而圓，少見雙核；模型組大鼠肝臟散在炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)；UDCA組大鼠肝臟無明顯炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生明顯改善；化肝通絡(luò)方低劑量組大鼠肝臟炎性細(xì)胞浸潤存在，纖維結(jié)締組織輕度增生；化肝通絡(luò)方中劑量組大鼠肝臟炎性細(xì)胞浸潤減少，少許纖維結(jié)締組織增生；化肝通絡(luò)方高劑量組大鼠肝臟無明顯炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生明顯改善。見圖1。

3.3 各組大鼠血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1表達(dá)比較見表2。

3.4 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7表達(dá)比較見表3。

表1 各組大鼠治療后肝功能生化指標(biāo)（±s）

表1 各組大鼠治療后肝功能生化指標(biāo)（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）ALT（U/L）AST（U/L）假手術(shù)組8 T-Bil（μmol/L）30.8±11.559.4±11.4 D-Bil（μmol/L）GGT（U/L）0.84±0.29 ALP（U/L）0.25±0.4258.38±1.8747.67±16.42 567.0±238.8##611.6±283.4##模型組854.06±9.70##40.38±4.90##254.43±23.37##318.38±198.90##UDCA組842.6±26.6**128.2±73.4**0.88±0.27**0.68±0.37**58.08±1.91**53.70±19.60**化肝通絡(luò)方高劑量組845.2±31.0**109.9±48.1**0.97±0.39**0.85±0.35**△59.04±3.14**55.90±26.13**化肝通絡(luò)方中劑量組834.6±18.3**△99.0±36.7**△1.07±0.28**△0.84±0.19**△57.66±3.71**49.78±23.19**化肝通絡(luò)方低劑量組8228±125.9**△△209.0±73.2**△1.56±0.62**△1.26±0.49**△58.20±1.84**114.56±95.29**△

圖1 各組大鼠肝組織病理變化（HE，200×）

表2 各組大鼠治療后血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1水平比較（±s）pg/mL

表2 各組大鼠治療后血清α-SMA、TIMP-1、ICAM-1水平比較（±s）pg/mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數(shù)假手術(shù)組α-SMATIMP-1 8 ICAM-1 507.01±17.99390.73±22.89186.84±7.89模型組81325.16±158.44##994.02±128.43#576.01±108.44##UDCA組8587.43±36.55**468.87±23.42*254.45±36.54**化肝通絡(luò)方高劑量組8650.35±52.04*△412.37±32.60**△268.36±52.04**化肝通絡(luò)方中劑量組8728.36±110.11*△549.99±44.47*△307.89±54.67*△化肝通絡(luò)方低劑量組81011.79±100.95*△△583.55±57.01*△407.51±100.95*△

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化染色的比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化染色的比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與UDCA組比較，△P＜0.05。

Smad3組別假手術(shù)組（n=5）灰度值相對光密度267.43±17.750.1745±0.0543 1795±357##1356±457##538±152##TGF-β1陽性數(shù)目陽性數(shù)目464±223502±274灰度值相對光密度163.89±9.870.1574±0.0184灰度值相對光密度177.78±18.650.1145±0.0234 Smad7陽性數(shù)目1787±254模型組（n=5）205.04±11.70#0.1734±0.0856#223.76±9.70#0.1534±0.0156#194.91±18.04#0.1200±0.0193#UDCA組（n=5）765±356*164.4±8.48*0.1344±0.0258*667±156*194.45±12.450.1344±0.0178*1556±467*223.56±8.700.1354±0.0146化肝通絡(luò)方高劑量組（n=5）832±236*187.6±10.44*△0.1234±0.0343*702±236*195.67±8.54*0.1234±0.0193*1695±357**235.04±11.70*0.1334±0.0856化肝通絡(luò)方中劑量組（n=5）1256±328*△189.87±9.45△0.1434±0.0146*△862±176**△232±8.45△0.1434±0.0156862±186*△217.91±8.45*△0.1234±0.0147化肝通絡(luò)方低劑量組（n=5）1395±223*△193.45±12.87△0.1540±0.0936*△896±423**△196.45±13.87*0.1210±0.1936*△896±417*△197.17±12.87△0.1278±0.0156

4 討論

近年來，中醫(yī)藥辨證施治治療膽汁性肝硬化取得了一定療效。現(xiàn)代醫(yī)家多依據(jù)病程的不同階段將本病分別歸屬于“皮膚瘙癢”、“黃疸”、“脅痛”、“鼓脹”、“積聚”、“水腫”、“血證”、“虛勞”等范疇[5]。本病虛實(shí)夾雜，本虛標(biāo)實(shí)。本虛以肝、脾、腎三臟為主，標(biāo)實(shí)以氣滯、濕濁（熱）、血瘀、水停等為主。腎主骨，肝主筋，肝腎精血不足，失于濡養(yǎng)，則患者多骨節(jié)疼痛、腰膝酸軟、發(fā)枯齒搖、經(jīng)水早閉、目澀口干。脾主運(yùn)化，運(yùn)化水谷精微及水濕，脾虛則納少便溏，濕濁內(nèi)阻，濕聚水停，腹脹足腫，久之則乏力倦怠，萎黃神疲。肝主疏泄，與膽腑互為表里，煩勞則肝失條達(dá)，氣滯血瘀、濕熱熏蒸則致黃疸[5-6]?；瓮ńj(luò)方由紅花、五靈脂、牛黃、印度獐牙菜、黃芪、木香等組成，其中紅花、五靈脂等活血通絡(luò)，牛黃、印度獐牙菜等清熱解毒、疏肝利膽，黃芪、木香等健脾理氣。全方具有清熱解毒、活血利水、理氣健脾、補(bǔ)益肝腎等功效。

肝纖維化是膽汁性肝硬化的重要中間環(huán)節(jié)，目前研究表明，肝纖維化的顯著特征是細(xì)胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）的增加和成分的改變，而肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化和增殖是其關(guān)鍵和中心環(huán)節(jié)[7]。α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的特征性標(biāo)志物[8]；TIMP-1與肝纖維化密切相關(guān)，TIMPs可選擇性地結(jié)合MMPs，抑制MMPs降解ECM的活性[9]；ICAM-1的表達(dá)是HSC活化的固有的生物學(xué)特性之一，ICAM-1為免疫球蛋白超家族的一種黏附分子，能表達(dá)于淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等表面，在炎癥反應(yīng)中，ICAM-1是細(xì)胞與細(xì)胞接觸過程中起中心作用的一種細(xì)胞黏附分子[10]。

TGF-β/smad細(xì)胞信號通路與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，TGF-β1參與活化肝星狀細(xì)胞并促進(jìn)膠原蛋白基因表達(dá)，肝臟纖維化使TGF-β1合成明顯增多，肝臟組織表達(dá)TGF-β1增強(qiáng)，而Smads蛋白家族作為TGF-β1膜受體的特異性底物，根據(jù)功能分為三類：膜受體激活Smad、通用Smad和抑制性的Smad。Smad3屬于激活的Smad，在肝纖維化發(fā)生時其表達(dá)顯著增加，具有活化、促進(jìn)膠原合成等效應(yīng)。與之相反，肝纖維化的進(jìn)展常常伴隨有抑制性激活的Smad7表達(dá)水平低下，因而不能有效地抑制激活的Smad磷酸化，并阻止TGF-β1的刺激信號向下游傳導(dǎo)，導(dǎo)致TGF-β1信號通路持續(xù)激活，最終發(fā)生肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典方法復(fù)制膽汁性肝硬化模型。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、T-Bil，D-Bil，GGT均顯著升高，α-SMA、TIMP-1、ICAM-1蛋白的表達(dá)也明顯升高，結(jié)合肝臟組織病理學(xué)改變，證實(shí)動物模型復(fù)制成功。本研究發(fā)現(xiàn)，化肝通絡(luò)方各劑量組能明顯降低膽汁性肝硬化模型大鼠血清中異常升高的肝功能指標(biāo)和α-SMA、TIMP-1、ICAM-1蛋白的表達(dá)。與模型組比較，化肝通絡(luò)方給藥濃度與療效呈正相關(guān)，其中以高劑量組最為顯著，存在濃度依耐性，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。與UDCA組比較，化肝通絡(luò)方高劑量組血清指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而中、低劑量組差異顯著，說明化肝通絡(luò)方高劑量組與陽性藥UDCA療效相近。同時病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，化肝通絡(luò)方高、中劑量組對模型大鼠肝纖維組織增生、肝組織炎性細(xì)胞活動有顯著的改善作用，進(jìn)一步證實(shí)化肝通絡(luò)方具有明顯的抗纖維化作用。肝組織免疫組化結(jié)果提示，模型組較假手術(shù)組TGF-β1、Smad3蛋白的陽性數(shù)目和灰度值、相對光密度表達(dá)增高，抑制性激活蛋白Smad7表達(dá)明顯降低，化肝通絡(luò)方及UDCA均可顯著抑制模型大鼠TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)，上調(diào)抑制性激活蛋白Smad7表達(dá)，說明化肝通絡(luò)方具有治療膽汁性肝硬化的作用，其作用機(jī)制可能與TGF-β/smad信號通路相關(guān)。

[1]Kyung-Ah Kim，Sook-Hyang Jeong.The diagnosis and treatment of primary biliary cirrhosis.Korean J Hepatology，2011，17（3）：173

[2]CorpechotC，Poujol-RobertA，Wendum D，etal.Biochemical markers of liver fibrosis and lymphocytic piecemeal necrosis in UDCA-treatedpatientswithprimarybiliarycirrhosis.Liver International，2004，24（3）：187

[3]Kuiper EM，Hansen BE，de Vries RA，et al.Improved prognosis ofpatientswithprimarybiliarycirrhosisthathavea biochemical response to ursodeoxycholic acid.Gastroenterology，2009，136（4）：1281

[4]Weiler-Normann C，herkel J，Lohse AW.Mouse models of liver ifbrosis.ZGmstroentero1，2007，45（1）：43

[5]蔣健，何淼.原發(fā)性膽汁性肝硬化的中醫(yī)證候特點(diǎn)及療效分析.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，17（3）：15

[6]李林，鐘德珍，鐘德雄，等.中西醫(yī)結(jié)合診治膽汁性肝硬化32例臨床觀察.北京中醫(yī)雜志，2002，21（5）：287

[7]FriedmanSL.Mechanismsofhepaticfibrogenesis.Gastroentero logy，2008，134：1655

[8]Carpino G，Morini S，et al.Alpha-SMA expression in hepatic stellate cells and quantitative analysis of hepatic fibrosis in cirrhosisandinrecurrentchronichepatitisafterliver transplantation.Dig Liver Dis，2005，37（5）：349

[9]Stefanie Hemmann，Jürgen.Expression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis-a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies.Journal of Hepatology，2007，46（5）：955

[10]Wen YA，Liu D.Biliary intervention aggravates cholestatic liver injury，andinduceshepaticinflammation，proliferationand fibrogenesis in BDL mice.Exp Toxicol Pathol，2011，63（3）：277

[11]Liu Y，Liu H，Meyer C，et al.Transforming growth factor-β （TGF-β）-mediated connective tissue growth factor（CTGF）expression in hepatic stellate cells requires Stat3 signaling activation.J Biol Chem，2013，288（42）：30708

R575.205文獻(xiàn)識別碼A

1672-397X（2014）03-0073-03

宣佶（1982-），男，碩士研究生，主治醫(yī)師，消化內(nèi)科專業(yè)。

田耀洲，tianyaozhou1960@163.com

2013-12-31

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金（81060255）；“江蘇省六大人才”高峰項(xiàng)目（2013-WS-048）；江蘇省科技廳技術(shù)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計劃項(xiàng)目（BM2008152）