糖脂清顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠心肌組織AT1R表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

顧震宇王旭洪兵尚文斌滕士超徐奚如俞晶華

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬淮安中醫(yī)院，江蘇淮安 223001；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

糖脂清顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠心肌組織AT1R表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

顧震宇1王旭1洪兵2尚文斌1滕士超3徐奚如3俞晶華1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬淮安中醫(yī)院，江蘇淮安 223001；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：觀察糖脂清顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠心肌組織血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）蛋白和mRNA表達(dá)的影響，探討其干預(yù)2型糖尿病大鼠心肌纖維化的機(jī)制。方法：雄性SD大鼠，采用高糖高脂飼料和一次性小劑量（30mg/kg）2%鏈脲佐菌素（STZ）溶液腹腔注射制作2型糖尿病模型。將模型大鼠分為模型組、厄貝沙坦組和糖脂清顆粒高、中、低劑量組，另取5只正常大鼠設(shè)為正常組，分別給藥或生理鹽水8周后，檢測(cè)心肌組織AT1R蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果：糖脂清高、中劑量組大鼠心肌組織AT1R蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于模型組，糖脂清低劑量組AT1R mRNA表達(dá)也較模型組顯著降低。結(jié)論：糖脂清顆粒通過抑制心肌組織AT1R蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制糖尿病大鼠心肌纖維化的發(fā)展。

糖脂清顆粒 糖尿病心肌纖維化 AT1R 實(shí)驗(yàn)研究

糖尿病心肌病是糖尿病心臟病的一類特異性病變。目前研究認(rèn)為，心肌間質(zhì)纖維化在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而心肌間質(zhì)纖維化可能與腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活（RAS）、細(xì)胞因子、內(nèi)皮素等多種因素有關(guān)。本研究以心肌組織的血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）為切入點(diǎn)，探討糖脂清顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠，清潔級(jí)，4～5周齡，體重180～220g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證：scxk浙20080033。每籠3只，分籠飼養(yǎng)，濕度40%～60%，室溫16～26℃。

1.2 主要藥物和試劑糖脂清顆粒（藥物組成：黃精、枸杞、澤蘭、僵蠶、鬼箭羽等），南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備提供。厄貝沙坦片（0.15g/片），賽諾菲（杭州）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：J20080061。高糖高脂飼料由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。拜安捷2血糖儀及血糖試紙條（拜耳公司），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），蛋白定量試劑盒（BIO-RAD公司），牛血清白蛋白（Sigma公司），兔抗鼠AT1R、β-actin單克隆抗體（美國Santa cruz公司），過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（丹麥Dako公司），Western Blotting Electro Chemiluminescence（Amersham公司），總RNA提取試劑Trizol reagent（美國Invitrogen公司），分子量標(biāo)準(zhǔn)品DNA marker（DL2000bp，大連TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和Oligo（dT）引物（美國Promega公司），PCR所需試劑（日本TaKaRa公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后一次性2%鏈脲佐菌素（STZ）溶液30mg/kg腹腔注射，3d后尾尖采血，測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L確定為糖尿病模型大鼠。

選取5只正常大鼠作為正常組；2型糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為5組，模型組、厄貝沙坦組和糖脂清高、中、低劑量組。中藥劑量按人體重70kg，大鼠平均體重500g體表面積計(jì)算。模型組及正常組灌服生理鹽水1m L/100g，糖脂清高、中、低劑量組給藥藥量分別為19.4、9.7、4.85g/（kg·d），厄貝沙坦組給藥劑量為10mg/（kg·d）。各組大鼠每日固定時(shí)段灌胃給藥1次，連續(xù)用藥8周。

2.2 心肌組織樣本的制備用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉迅速開胸取出心臟，以冰生理鹽水沖洗干凈，去除大血管、心房、右心室，快速切留適量心尖組織，經(jīng)液氮速凍后，凍存于-80℃冰箱中。

2.3 Western Blotting檢測(cè)大鼠心肌組織AT1R蛋白的表達(dá)

提取大鼠心肌總蛋白，采用BCA法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)的濃度，進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，用PBS-T洗膜2次，5min/次。使用阻斷劑37℃孵育1h，置于1∶1000稀釋的特異性抗體反應(yīng)液，4℃過夜。棄一抗，用PBS-T洗膜3次，5m in/次。加入含1∶5000稀釋的過氧化物酶酶聯(lián)二抗反應(yīng)液，37℃搖動(dòng)孵育2h。化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，顯影之后分析所測(cè)電泳條帶的性質(zhì)。β-Actin作為內(nèi)參照。

2.4 RT-PCR檢測(cè)大鼠心肌組織AT1R mRNA的表達(dá)取心肌組織進(jìn)行mRNA的提取，經(jīng)鑒定濃度和純度符合實(shí)驗(yàn)要求后，進(jìn)行cDNA第一鏈合成，取5μL RNA加入2μL的oligo（dT）15，70℃溫浴5min后，立刻取出至冰上冷卻，加入反轉(zhuǎn)錄體系（5×RT buffer 5μL，dNTP 1.25μL，RNA酶抑制劑0.625μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，無菌水10.125μL），總體積為25μL，37℃溫育60min，再70℃、15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶的活性，反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫中mRNA序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物。PCR反應(yīng)體系：模板，8μL；正反義引物各1μL；10倍濃度buffer（含Mg2+）2.5μL；10mmol/L dNTP 0.5μL；ddH2O 11.5μL；Taq酶0.5μL。總共25μL。PCR反應(yīng)條件：第一階段95℃，5m in，預(yù)變性；第二階段，94℃、30s，56℃、35s，72℃、45s，共35個(gè)循環(huán)；第三階段，72℃，10min，4℃，保存。β-Actin作為內(nèi)參照。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌組織AT1R蛋白的表達(dá)見表1，圖1。模型組大鼠心肌組織AT1R表達(dá)明顯增加，與正常組相比有顯著性差異（P＜0.01）；糖脂清高、中劑量組大鼠心肌組織AT1R的表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01）；糖脂清低劑量組與模型組相比降低，但無顯著性差異（P＞0.05）；糖脂清各劑量組與厄貝沙坦組相比無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織AT1R蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠心肌組織AT1R蛋白表達(dá)的比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織AT1R蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）AT1R正常組50.57±0.17模型組5 1.05±0.18**厄貝沙坦組5 0.62±0.18▲▲糖脂清高劑量組5 0.62±0.13▲▲糖脂清中劑量組5 0.67±0.14▲▲糖脂清低劑量組5 0.80±0.14

3.2 各組大鼠心肌組織AT1R mRNA的表達(dá)見圖2、表2。模型組大鼠心肌組織AT1R mRNA表達(dá)明顯增加，與正常組相比有顯著性差異（P＜0.01）；糖脂清高、中劑量組大鼠心肌組織AT1R mRNA的表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）；糖脂清低劑量組與模型組相比也明顯降低（P<0.05）；糖脂清各劑量組與厄貝沙坦組相比無明顯差異（P＞0.05）。

圖2 心肌組織AT1R基因表達(dá)

表3 各組大鼠心肌組織AT1R mRNA表達(dá)的比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織AT1R mRNA表達(dá)的比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）AT1R模型組5 0.89±0.05**厄貝沙坦組5 0.60±0.11▲▲糖脂清高劑量組5 0.62±0.14▲▲糖脂清中劑量組5 0.68±0.09▲▲糖脂清低劑量組5 0.73±0.10▲正常組50.49±0.08

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的造模方法和藥物干預(yù)療程（8周），參考了文獻(xiàn)[1-5]關(guān)于2型糖尿病大鼠心肌病變的研究而制定。糖尿病大鼠心肌病變的產(chǎn)生一般發(fā)生在造模成功后6～8周。朱禧星等[1]發(fā)現(xiàn)，在STZ造模成功糖尿病大鼠4周病程時(shí)，糖尿病大鼠心肌線粒體開始腫脹變性，8周時(shí)心肌酶含量明顯降低，心肌病變顯著，心肌排列不齊、斷裂和心肌收縮帶形成等。張芳林等[2]觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，證實(shí)2型糖尿病大鼠心臟病變出現(xiàn)于模型建立后1.5個(gè)月，并隨著病程延長而加重。另有國外文獻(xiàn)報(bào)道，STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)?～12周，心功能改變發(fā)生在6～14周[3-5]。

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的主要活性肽，通過組織細(xì)胞膜上的AT1R來發(fā)揮生理學(xué)作用，并與TGF-β1、CTGF、ET之間相互作用，共同促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。通過與AngⅡ結(jié)合，AT1R被激活，促進(jìn)尼克酰胺腺嘌呤二核苷（NADPH）氧化酶合成ROS，并進(jìn)一步激活下游的核因子-κB（NF-κB）信號(hào)蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用，其可能的機(jī)制有如下3點(diǎn)：（1）促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附1（VCAM-1）的生成，引起血管內(nèi)皮損傷，并且通過ERK促進(jìn)內(nèi)皮素（ET）的表達(dá)，引起血管的收縮；AngⅡ調(diào)節(jié)ET-1及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）表達(dá)，促進(jìn)了心肌肥厚和纖維化[6]。（2）通過激活轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）蛋白活性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚、凋亡及間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致心臟主動(dòng)和被動(dòng)舒張功能損傷[7]。（3）AngⅡ與心肌成纖維細(xì)胞上的AT1受體結(jié)合還能刺激心肌成纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原合成增加[8]。

糖尿病心肌病屬于中醫(yī)“消渴”“心悸”“胸痹”等范疇，主要由消渴病日久遷延所致。導(dǎo)師王旭教授根據(jù)中醫(yī)“瘀熱”和“久病入絡(luò)”的理論，認(rèn)為其基本病機(jī)是氣陰兩虛、痰瘀阻絡(luò)，并確立了“益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀”的治療原則，創(chuàng)立了中藥復(fù)方糖脂清顆粒，用于糖尿病心肌病的防治。

本實(shí)驗(yàn)采取Western Blotting和RT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法，觀測(cè)糖脂清顆粒對(duì)AT1R的影響，發(fā)現(xiàn)糖脂清顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠心肌AT1R蛋白及其mRNA的表達(dá)有抑制作用，該作用與厄貝沙坦相比無明顯差異，因此，糖脂清顆粒具有類似厄貝沙坦抑制AT1R的作用，從而影響下游通路，抑制心肌纖維化的發(fā)展。

[1]朱禧星，周曉朋，何德華，等.鏈脲佐菌素糖尿病大鼠的心臟病變.中華內(nèi)分泌代謝雜志，1992，8（4）：222

[2]張芳林，李果.2型糖尿病性心臟病變?cè)缙谙嚓P(guān)基因的篩選和分析.中華內(nèi)科雜志，2002，41（8）：530

[3]Ed W Thompson.Structuralmanifestations of diabetic cardiomyopathy in the rat and its reversal by insulin treatment. American Journal of Anatomy，1988，182（3）：270

[4]Fein FS，Kornstein LB，Strobeck JE，et al.Altered myocardial mechanics in diabetic rats.Circ Res，1980，47（6）：922

[5]Tahiliani AG，Vadlamudi RV，McNeill JH.Prevention and reversal of altered myocardial function in diabetic rats by insulin treatment.Can J Physiol Pharmacol，1983，61（4）：516

[6]Copaja Soto M，Valenzuela R，Saldana A，et al.Early expression of monocyte chemoattractant protein-1 correlates with the onset of isoproterenol-induced cardiac fibrosis in rats with distinct angiotensin-converting enzyme polymorphism.JRenin Angiotensin Aldosterone Syst，2008，9（3）：154

[7]Connelly KA，Kelly DJ，Zhang Y，et al.Functional，structural and molecular aspects of diastolic heart failure in the diabetic（mRen-2）27rat.Cardiovasc Res，2007，76（2）：280

[8]Dong B，Yu QT，Dai HY，et al.Angiotensin-converting enzyme-2 overexpression impr-oves left ventricular remodeling and function in a rat model of diabetic cardiomyopathy.J Am Coll Cardiol，2012，59（8）：739

R587.105

：A

：1672-397X（2014）12-0083-03

顧震宇（1981-），男，博士研究生，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)分泌與代謝病。

王旭，njzywangxu@126.com

2014-08-15

編輯：吳寧

江蘇省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2011817）；國家教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（20133237110004）