青敷膏治療大鼠體表金黃色葡萄球菌感染的實驗研究

朱宏 孫海艦 朱永康

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

青敷膏治療大鼠體表金黃色葡萄球菌感染的實驗研究

朱宏 孫海艦 朱永康

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：研究青敷膏外用的作用機制。方法：SD大鼠隨機分為飴糖組（空白組）、百多邦對照組以及青敷膏低、中、高劑量組，建立大鼠體表感染模型，應用相應藥物或賦形劑外敷或涂抹，每隔24h換藥1次，共治療3d。用藥結束后對各組大鼠局部組織取材，包括真皮、皮下組織、肌層及結締組織，石蠟包埋、HE染色，觀察急性炎癥反應以及中性粒細胞、單核細胞浸潤程度，細菌殘留及炎癥介質IL-6、IL-10釋放情況。結果：青敷膏高劑量組在急性炎癥反應指標上明顯低于飴糖組及百多邦對照組，青敷膏中、高劑量組在單核細胞浸潤指標上明顯低于青敷膏低劑量組、飴糖組，青敷膏高劑量組IL-6、IL-10指標明顯低于飴糖組、百多邦對照組。結論：一定濃度的青敷膏具有抗炎、抑制白細胞浸潤、抑制炎癥介質釋放的多重作用，對于體表感染金黃色葡萄球菌大鼠模型有明顯的治療效果。

金黃色葡萄球菌感染 青敷膏 實驗研究

江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑青敷膏是由青敷散與飴糖以一定比例調配而成，在臨床應用數(shù)十年，對初起的體表感染具有清熱解毒、活血消腫止痛的作用，臨床效果良好，然而其作用機制仍然不很清楚限制了其進一步開發(fā)應用。本研究制作大鼠表皮炎癥模型，予青敷膏外敷，觀察治療后急性炎癥反應以及中性粒細胞、單核細胞浸潤程度，細菌殘留及炎癥介質IL-6、IL-10釋放情況，以探討青敷膏外用抗感染的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物SD大鼠50只，雌雄各半，體重200～280g，由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證編號：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 菌種金黃色葡萄球菌ACTT 25923，濃度1×107個/mL，由江蘇省中醫(yī)院細菌室提供。

1.3 藥物及制備低、中、高濃度青敷膏，調配方法：臨床所使用青敷膏，青敷散與飴糖重量比為1∶3，確定為中劑量組，低劑量組青敷散與飴糖重量比為1∶6，高劑量組青敷散與飴糖重量比為1∶2。飴糖，莫匹羅星軟膏（百多邦，中美天津史克制藥有限公司生產(chǎn)，批號13080406），10%水合氯醛（由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供）。

1.4 試劑與儀器蒸餾水、中性福爾馬林液（4%），由江蘇省中醫(yī)院病理科提供。層流臺、取樣器、注射器、顯微鏡、HE染色設備、電動剃毛器、膠帶等，由江蘇省中醫(yī)院病理科、南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

2 實驗方法

2.1 造模與分組應用Elisabeth Kugelberg等[1]所設計的“膠帶剝脫法”建立大鼠表皮撕脫模型，然后在撕脫表皮部位滴注金黃色葡萄球菌液，作用約4h后完成細菌吸收[2-3]，經(jīng)檢測造模效果良好。

實驗大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別是青敷膏低、中、高劑量組和飴糖組（空白組）及百多邦對照組。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉，選擇大鼠背部皮膚作為實驗區(qū)，電動剃毛器剃去背部毛發(fā)，以寬約2cm膠帶連續(xù)粘扯背部軟毛，約30次左右脫去毛發(fā)和表皮層，以潮紅光亮見滲出為度，去除面積約3cm2。表皮剝脫后即刻于表皮剝脫處滴注5μL含1×107個/mL金黃色葡萄球菌菌液，靜置待蘇醒后單籠飼養(yǎng)。

2.2 給藥于滴注菌液后第2天，在創(chuàng)面應用青敷膏（低、中、高劑量）、飴糖及百多邦進行治療，每隔24h換藥1次，至第5天結束，共治療3d。青敷膏敷貼方法嚴格按我院方法施行，即以膏劑攤涂于綿紙上，厚約1mm，隔一層綿紙敷貼于創(chuàng)面，敷貼范圍大于炎癥腫脹范圍，外部以紗布2～4層覆蓋，膠帶紙環(huán)繞大鼠腹部，有效固定。飴糖組，以飴糖攤涂，敷貼方法同上。莫匹羅星軟膏（百多邦），按說明使用，用無菌棉簽蘸取后均勻涂抹于大鼠體表創(chuàng)面，實驗中統(tǒng)一用量。

2.3 取材方法用藥結束后脫頸椎處死大鼠，取脫皮局部靠近中心部包括皮膚至肌層各層組織約1cm2，置于中性福爾馬林（4%）中，分別行HE染色和革蘭氏染色，制作病理標本切片。

2.4 檢測項目觀察病理切片的急性炎癥反應、中性粒細胞浸潤、單核細胞浸潤、細菌殘留情況。并按照表1的計分方法進行半定量檢測。

炎癥介質測定：炎癥介質IL-6、IL-10釋放采用免疫組化的方法進行檢測。免疫組化染色采用SP法（一抗和二抗均購自福建邁新生物技術開發(fā)公司）[4]，染色方法參照說明書進行，顯色使用DAB。光學顯微鏡下觀察免疫表型。

2.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS16統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。數(shù)值結果采用多重比較（LSD）及Student-Newman-Keuls統(tǒng)計組內(nèi)差異。

3 實驗結果

各組大鼠病理切片的急性炎癥反應、中性粒細胞浸潤、單核細胞浸潤、細菌殘留情況半定量檢測結果見表2。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，致病菌從體表侵入人體后，可造成局部感染的發(fā)生。在體表感染的發(fā)生發(fā)展過程中主要病理變化有變質、滲出和增生。一般病變的早期以變質和滲出為主，病變后期以增生為主。炎癥早期即發(fā)生局部的血流動力學改變，這些改變包括血管擴張和血流加速形成紅、熱現(xiàn)象，隨著血管擴張，血管通透性的升高，富含蛋白質的液體外滲出血管，導致血管內(nèi)紅細胞濃集和血黏度的增加，形成血流停滯，發(fā)生“瘀血”現(xiàn)象，一般損傷發(fā)生后的24～48h左右，此種現(xiàn)象最為明顯[5]。從中醫(yī)角度看，此時“形癥已成”，臨床可以應用相應的清熱解毒、活血消腫類外敷藥物治療[6]。炎癥反應最重要的功能是將白細胞輸送到損傷部位，白細胞游出是炎癥反應最重要的指征。游出的白細胞在炎癥局部可發(fā)揮吞噬和免疫作用，因而成為防御反應極其重要的一環(huán)。除此之外，白細胞對局部組織還有損傷和破壞作用。實驗考察白細胞的浸潤情況具有重要意義[7]。以HE染色半定量方法可以檢測局部感染組織的炎癥反應情況和藥物治療前后的中性粒細胞浸潤情況，在目前實驗研究中很容易做到且客觀可靠。

急性炎癥的血管擴張、通透性增加和白細胞滲出的發(fā)生機制，除了某些致炎因子可直接損傷血管內(nèi)皮外，這些炎癥反應主要是通過一系列化學因子的介導而實現(xiàn)的，這些因子稱為炎癥介質。炎癥介質作用于細胞可進一步引起靶細胞產(chǎn)生第二級炎癥介質，使最初炎癥介質進一步發(fā)揮作用或被抵消。這些炎癥介質常見的有白細胞介素類、前列腺素類、血小板激活因子、一氧化氮以及激肽補體系統(tǒng)等等。其中細胞因子白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素10（IL-10）參與免疫信號通路的調節(jié)[7]。本實驗選擇IL-6、IL-10作為炎癥觀察指標。由于激活了的單核細胞能生成并釋放多種細胞毒、干擾素和白細胞介素，單核細胞的浸潤減少，局部多種炎癥介質的釋放亦相應減少，從而減輕炎癥反應。本實驗證明，青敷膏中、高劑量能抑制單核細胞浸潤，減少局部炎癥介質的釋放，從而減輕局部炎癥反應。

青敷膏（蘇藥制字Z04000387）系我院具有傳統(tǒng)特色的清熱解毒類外敷藥物，臨床使用數(shù)十年，效果良好。原方見于清·馬培之著《急救百病濟世回生良方》，稱為青敷藥，《中醫(yī)外科學》附編方劑以“青敷散”為名收錄。藥物組成為大黃、姜黃、黃柏各240g，白及180g，白芷、赤芍、天花粉、青黛、甘草各120g。本院的青敷膏是以青敷散加飴糖調制而成。功能清熱解毒、活血消腫止痛。主藥青黛清熱解毒、涼血消腫[8-9]；黃柏清熱利濕解毒[10-11]；天花粉、白芷等祛濕消腫、散結止痛[12-13]；大黃既能清熱又能祛瘀[14]。其賦形劑飴糖能夠保持敷藥的黏性和濕潤，促進藥物成分的吸收。

本實驗證明，一定濃度的青敷膏具有抗炎、抑制白細胞浸潤、抑制炎癥介質釋放的多重作用，對于體表感染金黃色葡萄球菌大鼠模型有明顯的治療效果。

表1 計分方法

表2 各組大鼠相關指標檢測結果（±s）分

表2 各組大鼠相關指標檢測結果（±s）分

注：*與飴糖組比較，P＜0.05；#與百多邦對照組比較，P＜0.05；△與青敷膏低劑量組比較，P＜0.05。

[1]Elisabeth Kugelberg，Tobias Norstrm，Thomas K，et al.Establishment of a Superficial Skin Infection Model in Mice by Using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes.Eur.J. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2005，49（Suppl.8）：3435

[2]Chiller K.，B.A.Selkin，G.J.Murakawa.Skinmicroflora and bacterial infections of the skin.J.Investig.Dermatol.Symp.Proc，2001，6：170

[3]Soriano F.，L.Aguilar，C.Ponte.In vitro antibiotic sensitivitytesting breakpoints and therapeutic activity in induced infections in animal models.J.Chemother，1997，9（Suppl.1）：36

[4]王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學技術.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：364

[5]李玉林.病理學.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：58

[6]潘立群，崔學教.中醫(yī)外科學.北京：科學出版社，2007：27

[7]黃秋菊，季暉，賴宜生，等.ZLJ-601抗炎作用及其機制研究.中國藥科大學學報，2008，39（4）：333

[8]李東，武彥舒，王燦，等.青黛鎮(zhèn)痛、抗炎藥效學研究.中國實驗方劑學雜志，2011，17（13）：137

[9]杜立陽，劉悅，宗士群.青黛顆?？寡?、鎮(zhèn)痛作用的實驗研究.中國醫(yī)科大學學報，2003，32（4）：475

[10]胡俊青，胡曉.黃柏化學成分和藥理作用的現(xiàn)代研究.當代醫(yī)學，2009，15（7）：139

[11]李峰，賈彥竹.黃柏的臨床藥理作用.中醫(yī)藥臨床雜志，2004，16（2）：191

[12]楊新科，陳章良，段淑敏，等.天花粉蛋白在組織培養(yǎng)上抗病毒作用的研究.病毒學報，1990（3）：219

[13]王春梅，崔新穎，李賀.白芷香豆素的抗炎作用研究.北華大學學報（自然科學版），2006，7（4）：319

[14]高學敏.中藥學.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：157

編輯：吳寧

R632.05

A

1672-397X（2014）08-0074-02

朱宏（1980-），男，醫(yī)學碩士，主治中醫(yī)師，從事中西醫(yī)結合普外科臨床工作。njtcm1998@163.com

2014-05-09