人參皂苷免疫納米對(duì)裸鼠人胃癌NUGC-4組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D表達(dá)的影響

戴小軍1 王維民2 羅玉妍3 郁梅4 吳永健1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)揚(yáng)州附屬醫(yī)院、揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225002；2.宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興 214200；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；4.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001）

人參皂苷免疫納米對(duì)裸鼠人胃癌NUGC-4組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D表達(dá)的影響

戴小軍1 王維民2 羅玉妍3 郁梅4 吳永健1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)揚(yáng)州附屬醫(yī)院、揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225002；2.宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興 214200；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；4.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001）

目的：觀察人參皂苷免疫納米（VRIN）對(duì)裸鼠人胃癌NUGC-4組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D（VEGF-D）表達(dá)的影響，探討VRIN防治胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。方法：24只裸鼠建立NUGC-4人胃癌原位移植模型，并隨機(jī)分為生理鹽水組、5-氟尿嘧啶（5-Fu）組及VRIN組，每組8只，分別給予生理鹽水、5-Fu和VRIN干預(yù)后，采用免疫組織化學(xué)和Real time-PCR方法檢測(cè)瘤組織VEGF-D蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與生理鹽水組比較，VRIN對(duì)胃癌NUGC-4細(xì)胞裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，對(duì)腫瘤組織中VEGF-D蛋白和mRNA水平的表達(dá)有明顯下調(diào)作用。結(jié)論：VRIN可抑制人胃癌細(xì)胞祼鼠移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，調(diào)控淋巴管生長(zhǎng)因子VEGF-D蛋白和mRNA的表達(dá)是VRIN防治胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一。

人參皂苷Rg3 免疫納米乳 胃腫瘤 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D 實(shí)驗(yàn)研究

胃癌是主要以淋巴轉(zhuǎn)移為擴(kuò)散途徑的惡性腫瘤，但經(jīng)歷數(shù)十年的研究仍未能完全闡明其機(jī)理和意義。近年來(lái)，隨著血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）等特異作用于淋巴管內(nèi)皮的生長(zhǎng)因子及受體的發(fā)現(xiàn)，抑制胃癌細(xì)胞分泌VEGF-D或阻斷VEGF-D與受體VEGFR-3結(jié)合，成為胃癌轉(zhuǎn)移方面的研究熱點(diǎn)，阻斷或抑制淋巴轉(zhuǎn)移是提高胃癌療效的關(guān)鍵[1-2]。本課題組以抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3抗體（VEGFR-3 antibody）為介導(dǎo)，制備人參皂苷Rg3腫瘤靶向免疫納米乳劑（VRIN）。本研究通過(guò)建立裸鼠人胃癌NUGC-4原位移植模型，觀察VRIN對(duì)裸鼠人胃癌模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和淋巴管生長(zhǎng)因子VEGF-D表達(dá)的影響，探討VRIN在防治胃癌淋巴轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與瘤株SPF級(jí)BALB/c無(wú)胸腺裸鼠24只，雄性，6周齡，18～20g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）20120004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2010-0004。紅色熒光蛋白標(biāo)記人胃癌細(xì)胞株NUGC-4-RFP，由美國(guó)AntiCancer.Inc公司提供，將含5×106細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成瘤后，傳代成實(shí)體瘤。

1.2 主要藥物與試劑人參皂苷Rg3腫瘤靶向免疫納米乳劑（VRIN）：由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院天然藥物研究室采用聚乙二醇法制備，VRIN為淡黃色澄清透明液體，TEM觀察其乳滴為球形，20℃條件下測(cè)定其粘度為（1.09±0.03）mPa·s，電導(dǎo)率為（368.45±0.84）μs/cm，pH值為（7.86±0.12），折光率為（1.3379± 0.0009），25℃條件下測(cè)定其Zeta電位平均值為-11.8mV，平均粒徑為137.9nm，偶聯(lián)率為895ng。VEGFR-3抗體/1mg人參皂苷Rg3、5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：201203211；VEGF-D一抗，購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；即用型免疫組化Maxvision2鼠兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自Fermentas Trizol公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥取皮下種植生長(zhǎng)的NUGC-4-RFP胃癌腫瘤，在培養(yǎng)液中分割成1mm×1mm的組織碎塊。采用肌肉注射麻醉的方法麻醉小鼠，待裸鼠痛覺(jué)消失后，在8倍外科手術(shù)用顯微鏡下，采用顯微外科手術(shù)的方法，用手術(shù)剪在裸鼠左腹部做一1cm的縱切口，剪開皮膚和腹膜，暴露胃。用8-0外科手術(shù)用線將1塊NUGC-4-RFP組織碎塊植入裸鼠胃大彎部，之后用5-0外科縫線關(guān)閉腹腔，整個(gè)操作過(guò)程在超凈工作臺(tái)中完成。24只裸鼠同時(shí)造模后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組、5-Fu組和VRIN組，每組8只。造模后第9天開始給藥。生理鹽水組給予生理鹽水尾靜脈注射，每只0.2mL/次，Q2d×15；5-Fu組給予5-Fu注射液腹腔注射，按照20mg/kg標(biāo)準(zhǔn)，每周1次，連續(xù)3周；VRIN組給予VRIN尾靜脈注射，按照1mg/kg標(biāo)準(zhǔn)，Q2d×15。各組藥物干預(yù)結(jié)束后，經(jīng)麻醉脫頸處死荷瘤鼠，將裸鼠解剖并進(jìn)行開放式熒光成像，根據(jù)紅色熒光的表達(dá)來(lái)判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。快速切取原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，分別置于4%甲醛與液氮中備用。

2.2 胃癌組織中VEGF-D蛋白表達(dá)檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)移植瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)情況。二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。在10×20倍視野下選取3個(gè)視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)所選視野進(jìn)行圖像采集，并用Moti Image Advaneed 3.0圖像分析軟件檢測(cè)其陽(yáng)性信號(hào)，以平均光密度值反映VEGF-D表達(dá)的強(qiáng)弱，光密度值越高，VEGF-D的表達(dá)就越強(qiáng)。

2.3 胃癌組織中VEGF-D mRNA表達(dá)檢測(cè)采用Real time-PCR方法。取胃癌組織，使用TRIZOL試劑提取腫瘤組織總RNA，檢測(cè)吸光度（A）值，所提取的RNA純度A260/A280均在1.8～2.1。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行Real-time PCR。引物的設(shè)計(jì)與合成：參照GenBank中的基因序列，使用Primer Premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)。

GAPDH引物序列——GAPDH上游引物F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'，擴(kuò)增片段為137bp；VEGF引物序列——VEGF-D上游引物F：5'-GGACTCTCGCTCAGCATCCCATC-3'，VEGF-D下游引物R：5'-CCACCTCCACGCACGTTTCTCTA-3'，擴(kuò)增片段為131bp。上述引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為25μL，SYBR Green PCR Master Mix（2×）10μL，10μmol/L上下游引物各1μL，雙蒸水7μL，cDNA 1μL。反應(yīng)條件：95℃變性5min，95℃15s，60℃30min，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行溶解曲線分析，每個(gè)標(biāo)本均作3個(gè)復(fù)孔；PCR產(chǎn)物定量的校正和判定分析：采用GAPDH作為內(nèi)參照。VEGF-D mRNA和GAPDH mRNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出mRNA的分子拷貝數(shù)，用GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，即目的基因mRNA精確含量=目的基因Ct值/內(nèi)參照GAPDH Ct值，以此比值作統(tǒng)計(jì)處理。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料用（±s）表示，首先用Levene檢驗(yàn)（Homogeneity of variance test）進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，采用完全隨機(jī)的方差分析（ANOVA），多個(gè)均數(shù)的比較用LSD-t檢驗(yàn)；如各個(gè)組總體方差不齊，則采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）定為0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較當(dāng)生理鹽水組腫瘤平均體積達(dá)到1278.6mm3時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。裸鼠被解剖后，熒光系統(tǒng)觀察可見(jiàn)部分動(dòng)物腸系膜、腹主動(dòng)脈旁及腹股溝等淋巴結(jié)腫大。生理鹽水組、5-Fu組和VRIN組的淋巴轉(zhuǎn)移率分別為87.5%（7/8）、50.0%（4/8）和12.5%（1/8）。與生理鹽水組比較，VRIN組淋巴轉(zhuǎn)移率明顯降低（P＜0.01），而5-Fu組降低無(wú)顯著性意義（P＞0.05）；VRIN組與5-Fu組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)切除標(biāo)本進(jìn)行HE染色顯示移植腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)均為低分化腺癌。

3.2 各組原位移植瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中均可見(jiàn)到VEGF-D陽(yáng)性染色，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞以腫瘤細(xì)胞為主，主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。兩用藥組腫瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)均明顯低于生理鹽水組（P＜0.05），兩用藥組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組原位移植瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組原位移植瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05。

3.3 各組原位移植瘤組織中VEGF-DmRNA表達(dá)比較見(jiàn)表2。與生理鹽水組比較，VRIN組、5-Fu組均可下調(diào)VEGF-D mRNA表達(dá)水平，VRIN組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而5-Fu組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩用藥組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組原位移植瘤組織中VEGF-D mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組原位移植瘤組織中VEGF-D mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05。

4 討論

防治腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是目前胃癌防治工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的主要途徑，近年來(lái)，隨著VEGF-C和VEGF-D等淋巴管生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)，使胃癌淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制研究得以深入。VEGF-D是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族的新成員，位于Xp22.34[3]。VEGF-D是目前已知的促淋巴管生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)淋巴管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，在淋巴管生成機(jī)制中起重要作用。VEGF-D與其受體VEGFR-3的胞外區(qū)域高度特異性結(jié)合，使受體自身磷酸化而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)淋巴管生成，參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程。VEGF-D在胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。

人參作為傳統(tǒng)中藥家喻戶曉，其提純的重要活性成分之一的人參皂苷Rg3分子式是C42H72O13，屬四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷單體，其抗腫瘤作用已從多發(fā)面被證實(shí)，包括：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管新生、逆轉(zhuǎn)化療耐用、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)[6-7]。我國(guó)自行開發(fā)的第一個(gè)在臨床應(yīng)用的抗腫瘤中藥一類新藥參一膠囊的主要活性成分就是Rg3。然而Rg3口服后血漿濃度很低，3.2mg/kg口服后的Cmax值僅為（15.67±6.14）ng/mL[8]。為了提高Rg3在體內(nèi)的生物利用度，需要設(shè)計(jì)一種更加安全高效的Rg3制劑。

本課題研究的人參皂苷Rg3免疫納米乳劑（VRIN）是采用聚乙二醇法制備，將VEGFR-3抗體與人參皂苷Rg3納米乳結(jié)合的新制劑。研究證實(shí)人參皂苷免疫納米VRIN組對(duì)胃癌NUGC-4細(xì)胞裸鼠移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；下調(diào)腫瘤組織中VEGF-D蛋白和mRNA水平的表達(dá)，與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此人參皂苷免疫納米VRIN可有效抑制胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，調(diào)控淋巴管生長(zhǎng)因子VEGF-D蛋白和mRNA水平的表達(dá)，可能是VRIN防治胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制之一。

本研究中利用可穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的裸鼠原位移植胃癌模型對(duì)人參皂苷Rg3免疫納米乳劑（VRIN）抗胃癌轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行了探索研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相似報(bào)道。研究結(jié)果提示VRIN是一種非常有潛力的抗胃癌轉(zhuǎn)移治療藥物，值得進(jìn)一步深入研究。

[1]鄧靖宇.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在胃癌臨床研究中的現(xiàn)況.中國(guó)腫瘤臨床，2013，40（22）：1370

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R735.2

A

1672-397X（2014）08-0076-03

戴小軍（1979-），男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究工作。dxj2319@sinan.com

2014-03-02

編輯：吳寧

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001589）；江蘇省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（HZ07101）