對廣金錢草不同部位總黃酮的含量分析

陳小英張瑞輝黎婉紅葉志瓊李泳斌

（1 云浮市人民醫(yī)院，廣東 云浮 527300；2 云浮市藥檢所，廣東 云浮 527300）

對廣金錢草不同部位總黃酮的含量分析

陳小英1張瑞輝1黎婉紅1葉志瓊1李泳斌2

（1 云浮市人民醫(yī)院，廣東 云浮 527300；2 云浮市藥檢所，廣東 云浮 527300）

目的用紫外分光光度法對廣金錢草中不同部位的總黃酮含量進(jìn)行測定，以便更好地對廣金錢草開發(fā)和利用。方法以蘆丁為對照品，用三氯化鋁為絡(luò)合劑，HAc-NaAc（pH=5.5）為緩沖液，采用紫外分光光度法測定。結(jié)果廣金錢草的因環(huán)境條件等差異總黃酮量亦不同，野生連錢草的含量無論部位和平均含量都較種植要高，比較測量二者莖、葉、全草的含量分別為種植：10.81、15.85、13.29 mg/g，而野生：15.49、22.89、18.69 mg/g。結(jié)論廣金錢草總黃酮含量分布表明葉＞全草＞莖。該方法操作性強(qiáng)，有助于對其藥材質(zhì)量控制，更好地對廣金錢草的開發(fā)和利用。

廣金錢草；不同部位；總黃酮；含量分析

1 儀器與試劑

1.1 儀器：UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì)（上海兄尼柯儀器有限公司），EX223電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司），DHG-9003型電熱恒溫。鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），VCY-100超聲波處理器VCY-100超聲波處理器VCY-100超聲波處理器VCY-900（上海研永超聲設(shè)備有限公司），玻璃柱（1.5 cm× 20 cm，江陰市新輝層析設(shè)備有限公司），柱層析用聚酰胺（100-200目），F(xiàn)w-100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。樣品野生品采自云浮市新興縣車崗鎮(zhèn)街附近，培養(yǎng)種植品購于云浮一卓醫(yī)藥公司，采集時間均為采收期9月中旬，后由云浮藥檢所李泳斌檢驗(yàn)員鑒定為廣金錢草正品。

1.2 試劑：蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙醇、純化水、氯化鋁、HAc-NaAc緩沖液等，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備：精密稱取在120 ℃下干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁6.29 mg，置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇適量后水浴上加熱，溶解后靜置冷卻，向容量瓶加再入50%乙醇至刻度，定容，制得濃度為0.2516 mg/mL的無水蘆丁對照品。

2.2 樣品試液的制備

2.2.1 樣品預(yù)處理：將采集鮮品按莖、葉和地上部位（全草）分離后晾置10 d，分別置于電熱恒溫干燥箱100 ℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎成0.45 mm粉末，混勻，分別裝入干凈的廣口瓶，存放在干燥器里，待用。

表1 對照品和供試品的某—濃度吸光度的變化

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 總黃酮的提取：分別各樣品粉末精密稱取0.4 g，置于塞錐形瓶中，精密加入50%的乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，過聚酰胺柱（濕法裝柱法），以50%乙醇洗脫，收集洗脫液并定容至50 mL，搖勻，靜置[4]。

2.3 波長的選擇：參考文獻(xiàn)選擇在272 nm處作為測得最大吸收度的波長[5]。

2.4 線性關(guān)系的考察：精確量取對照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分置于25 mL容量瓶中，分別加入三氯化鋁（0.1 mol/L）1.0 mL，HAc-NaAc緩沖液（pH=5.5）1.0 mL，以水稀釋至刻度，搖勻，以試劑作空白，在272 nm波長處測定。以對照品濃度和其吸光度值關(guān)系得回歸方程：Y=0.037X-0.034，r=0.996蘆丁濃度在5.032～25.16μg/mL（吸光度A：0.152～0.896）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度的考察：取蘆丁對照品適量，配成測定范圍濃度對照品試液；另取預(yù)供試品（全草）適量，按照2.2.2方法配制成供試液。各取適量溶液在60 min內(nèi)分別測量5次，觀察其測定吸收度變化。結(jié)果表明，該法的精密度良好，其測量吸收度RSD分別為：0.23%，0.26%（表1）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取各部分供試品溶液3 mL三份，加入顯色劑后于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min時分別測定吸光度。結(jié)果表明，樣品的總黃銅化合物與鋁離子形成的在70 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.32%（n=6）。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)：取本品同一批樣品（全草）5份.按“2.2.2”項(xiàng)平行值得供試品，測定吸收度.并計(jì)算含量，其含量的RSD%為1.3%，顯示實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知含量的廣金錢草（13.82 mg/g）藥材5份，約0.3 g，制成供試液后分別定量加入適量對照品溶液1、2.5、5、7.5、10 mL（0.2516 mg/mL，采用高中低五組份量分別加樣）按測定法進(jìn)行試驗(yàn)，得平均回收率為102.2%，RSD1.73%，見表2。

2.9 廣錢草不同部位的總黃酮分析：分別取野生及種植廣金錢草各3批次，樣品分取莖、葉、全草不同部位經(jīng)預(yù)處理后，在優(yōu)化條件下的超聲波法提取總黃酮，標(biāo)準(zhǔn)濃度三氯化鋁液顯色，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制各項(xiàng)下的方法，加入顯色劑依次測定，計(jì)算，結(jié)果如表3所示。

表3 不同生長條件的廣金錢草各部位總黃酮的分析

3 討論與總結(jié)

3.1 討論

3.1.1 采收期的確定：考慮廣金錢草的生長特性，通過對不同采收期總黃酮的含量抽樣監(jiān)測，選擇在9月中旬，另外從產(chǎn)量上來看，因此時為廣金錢草開始開花的時期，其葉茂盛、莖粗壯，便于采收。

3.1.2 提取黃酮的條件考察：目前，黃酮類提取方法較多，本研究選用較為高效的超聲波輔助提取廣金錢草的總黃酮，選取提取時間、超聲頻率、提取溫度、提取液濃度、提取次數(shù)比5個因素進(jìn)行單因素正交試驗(yàn)，考察5個因素對其總黃酮得率的影響，發(fā)現(xiàn)用超聲提取實(shí)驗(yàn)條件在功率500 W，提取溫度40 ℃，超聲時間55 min，以乙醇50%濃度試劑提取兩次時的提取率最高，其中影響廣金錢草總黃酮提取率各因素主次關(guān)系為：提取溫度＞超聲時間＞溶劑濃度＞超聲頻率＞提取次數(shù)，故選為最佳提取條件。

3.2 測定方法的選定：目前黃酮類化合物的含量測定方法有高效液相法、比色法紫外分光法等，其中高效液相法操作要求和綜合實(shí)驗(yàn)成本都較高，據(jù)研究，廣金錢草中的黃酮類成分較多，包括異牡荊苷、夏佛塔苷以及異葒草苷等化合物[6]，而采用傳統(tǒng)的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法因受非黃酮物質(zhì)雜質(zhì)的影響較大，容易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。另外陳思妮，張振秋等[7]用異牡荊苷做為對照品雖可直接法測定總黃酮的含量，但尋找對照品較困難，故亦不采用。

本實(shí)驗(yàn)含量測定結(jié)果可看出，廣金錢草中總黃酮的含量在l%～3%之間，與陳豐連等報道相符[6]，但野生和種植連錢草的總黃酮含有一定差異（表3），推測與特殊地理氣候、遺傳多樣性和人工育種密切相關(guān)?？傸S酮類成分葉片含量要高于根莖及全草，野生的要比種植含量要高，為充分開發(fā)利用提供重要參考。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:144.

[2] 崔秀梅.金錢草與廣金錢草的區(qū)別[J].光明中醫(yī),2011,26(3):606-607.

[3] 范樹國,王恩忠,邱璐,等.廣金錢草中生物堿的提取方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,2(1):301-303.

[4] 陳連豐.廣金錢草規(guī)范化種植與藥材質(zhì)量研究[J].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[5] 陳潔.紫外分光光度法測定石淋通片中總黃酮含量[J].中國民康醫(yī)學(xué),2009,21(12):1456-1457.

[6] 陳豐連,馬鑫斌,徐鴻華,等.不同產(chǎn)地廣金錢草藥材質(zhì)量研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2010,26(3):249-251.

[7] 陳思妮,張振秋.紫外分光光度法測定廣金錢草中總黃酮的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(12):36-37.

R284

B

1671-8194（2014）13-0077-02廣金錢草（Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.）是一種廣泛應(yīng)用的中藥材，來源豆科的山螞蝗屬植物的干燥地上部分[1]，分布于長江以南的地區(qū)，其中兩廣、福建、湖南為主產(chǎn)區(qū)[2]。具有清熱、除濕、利尿等功效。其入藥枝葉等含有生物堿、黃酮苷、酚類、鞣質(zhì)等多種活性成分[3]，其中所含黃酮類物質(zhì)更具有多種藥理活性，總黃酮成分具有顯著增加人體的冠脈血流量，并可抗炎，以及改善血液循環(huán)等臨床作用，本文對廣金錢草的全草、葉和莖中的總黃酮含量情況進(jìn)行分析，以便更好地對廣金錢草開發(fā)和利用。