維甲酸對(duì)腦出血大鼠LINGO—1表達(dá)的影響

梁順利　吳憂　張榮博　章水晶　徐彬

[摘要]目的 觀察腦出血后LINGO-1表達(dá)的變化，探討維甲酸對(duì)腦出血后LINGO-1表達(dá)的影響。方法 將72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和維甲酸治療組，選取造模后1d，3d，7d和14d為觀察點(diǎn)。制備腦出血模型，Longa評(píng)分法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度，RT-PCR法檢測(cè)LINGO-1 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)LINGO-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 模型組Longa 評(píng)分7d最高，14d出現(xiàn)下降；LONG-1 mRNA 3d表達(dá)最高，7～14d出現(xiàn)下降；LONG-1蛋白7d到高峰，14d出現(xiàn)下降。維甲酸治療組在14d Longa評(píng)分較模型組下降（P<0.05）；在7d和14d LINGO-1mRNA表達(dá)較模型組下降（P<0.05）；在14d LINGO-1蛋白表達(dá)較模型組下降（P<0.05）。結(jié)論 腦出血后LINGO-1表達(dá)明顯上調(diào)，呈先上升后下降的變化規(guī)律。維甲酸可以降低LINGO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)及神經(jīng)功能評(píng)分。

[關(guān)鍵詞] 含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的勿動(dòng)蛋白受體作用蛋白；腦出血；維甲酸；神經(jīng)再生

中圖分類號(hào)：R743.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-816X

[Abstract] Objective To explore the effect of retinoic acid on expressions of LINGO-1 in rats after intracerebral hemorrhage （ICH）. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， and retinoic acid group. Observation was made at 1，3，7，14d after ICH. Neurological functional recovery was evaluated by Longas score； RT-PCR and Western blot were applied to detect the changes in the expressions of LINGO-1 mRNA and protein. Results Longas score and LINGO-1 protein were decreased at 14d after ICH in retinoic acid group compared with those in model group（P<0.05）。 The LINGO-1 mRNA was decreased at 7d and 14d after ICH in retinoic acid group compared with model group（P<0.05）. Conclusions The decreased expressions of LINGO-1 and neurological score induced by retinoic acid might be one of the mechanisms of neural function recovery after ICH.

[Key words] LINGO-1； Intracerebral hemorrhage； Retinoic acid； Nerve regeneration

腦出血（Intracerebral hemorrhage， ICH）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，最終導(dǎo)致持久的功能損害，其原因?yàn)橹袠猩窠?jīng)損傷后再生能力的缺乏。近年研究發(fā)現(xiàn)勿動(dòng)蛋白（Nogo）與神經(jīng)再生障礙有關(guān)，抑制Nogo或受體復(fù)合物可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)[1]。含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo受體作用蛋白（Leucine rich repeat and Ig domain containing， Nogo receptor interacting protein， LINGO-1）是Nogo受體復(fù)合物中的一種重要的跨膜蛋白，負(fù)向調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，軸突再生， 髓鞘形成和神經(jīng)元存活[3]。研究表明抑制LINGO-1的表達(dá)能延長(zhǎng)神經(jīng)軸突和改善神經(jīng)功能。維 甲酸（retinoic acid，RA） 是脂溶性維生素A的衍生物，在缺血性卒中和脊髓損傷的研究中能抑制LINGO-1的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但LINGO-1在ICH方面的研究甚少。本研究觀察RA對(duì)ICH后LINGO-1表達(dá)的影響，旨在探討LINGO-1在ICH中的可能作用及維甲酸對(duì)ICH的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：清潔級(jí)雄性成年SD大鼠72只，體重180-220g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分三組，即假手術(shù)組（n=24），模型組（n=24）和RA治療組（n=24）。

每組又分為術(shù)后1d，3d，7d，14d四個(gè)小組，每小組各6只。

大鼠腦出血模型制備： 參照Yang[4]報(bào)1.2 道的方法：術(shù)前4 h禁食不禁水，稱重后用10%

水合氯醛按350mg/kg腹腔麻醉，俯仰立體定向儀上并固定，用微量注射器從大鼠近尾段的尾動(dòng)脈抽取50？l新鮮不凝血，在立體定向儀引導(dǎo)下按20？l/min的速度緩慢勻速緩慢注入左側(cè)尾狀核（前囟前0.2mm，左側(cè)中線旁開3mm，深度5mm）。注血結(jié)束后留針15min等血液凝固后慢慢拔針，保溫至蘇醒后分籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組在相同部位緩慢注入50？l生理鹽水，其余步驟同上。RA治療組RA用二甲基亞砜溶解成濃度為3mg/ml的溶液，于造模成功后腹腔注射，每只大鼠每天10mg/kg，連用14d；模型組每只大鼠每天3.3ml/kg的生理鹽水腹腔注射；假手術(shù)組術(shù)后不做任何處理。

1.3 LINGO-1 mRNA檢測(cè)： 采用RT-PCR法檢測(cè)：腦組織取自出血灶周，所得RNA用紫外線分光光度計(jì)定量測(cè)量RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體積10μl，37 ℃孵育15 min，85 ℃，5 s 終止反應(yīng)，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。引物序列如下：LINGO-1 引物序列為上游5-GCCACCTGGTCTATCT CCGTTTC-3，下游5-GCAGGTAATTGAGCCCACGAAA G-3（162 bp）。內(nèi)參ACTIN 上游5-CG TTGACATCCGTAAAGACCTC-3，下游5-TAGGAGC CAGGGCAGTAATCT -3（110 bp），均由武漢谷歌生物有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)94 ℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5min。RT-PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳條帶用美國(guó)Quantity-one凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參照吸光度比值。

1.4 LINGO-1蛋白檢測(cè)：采用Western blot法檢測(cè) ：出血灶周腦組織在PBS中勻漿，離心，加入裂解液后置于冰上不斷攪拌，后于4 ℃離心8 min，上清液用3倍緩沖液稀釋，100℃煮5min制樣，用于SDS-PAGE。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用1% 酪蛋白封閉液封閉膜1h，在0.5%封閉液稀釋的一抗中4℃過夜。洗膜后在HRP標(biāo)記的二抗搖床孵育2h，漂洗后在化學(xué)發(fā)光溶液中顯色，用ChemiDoc XPS 系統(tǒng)掃描，用Image Lab 4.0圖像軟件測(cè)量LINGO-1蛋白和β-actin 蛋白各顯色條帶的平均光密度比值。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分：參考 Longa[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在造模成功后1d，3d、7d、14d分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0 分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀。1 分：提尾懸空時(shí)對(duì)側(cè)前肢呈屈曲，不能完全伸展。2 分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3 分：站立時(shí)向?qū)?cè)傾倒。4 分：不能自行行走，意識(shí)下降。0分和4分大鼠不納入模型組和RA治療組，假手術(shù)組評(píng)分不限。當(dāng)大鼠數(shù)量減少時(shí)再按隨機(jī)方法予以補(bǔ)足每組大鼠數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS18.0版軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（）表示，統(tǒng)計(jì)方法用單因素方差分析，組組比較方差齊者用LSD法，RA治療組各時(shí)間點(diǎn)對(duì)LINGO-1蛋白表達(dá)與Longa評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能Longa評(píng)分：假手術(shù)組Longa評(píng)分均低，各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；模型組與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分均增高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且7d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量最高，14d出現(xiàn)下降；RA治療組與模型組比較，在1d，3d，7d時(shí)間點(diǎn)，Longa評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在14d時(shí)間點(diǎn)，Longa評(píng)分下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示14天RA治療組較模型組神經(jīng)功能恢復(fù)程度較好，見表1。

2.2 LINGO-1 mRNA：表達(dá)變化：假手術(shù)組LINGO-1 mRNA僅少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；模型組1d，3d，7d及14d LINGO-1 mRNA 表達(dá)與假手術(shù)組相比均明顯升高（P<0.05），3d 時(shí)間點(diǎn)表達(dá)最高，7d至14d 表達(dá)呈下降趨勢(shì)；RA治療組LINGO-1 mRNA表達(dá)，在1d和3d時(shí)間點(diǎn)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），在7d和14d 時(shí)間點(diǎn)較模型組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見表2。

2.3 LINGO-1蛋白表達(dá)變化：假手術(shù)組LINGO-1蛋白表達(dá)量少，各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；模型組1d，3d，7d及14d LINGO-1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比均明顯升高（P<0.05），且在7d達(dá)高峰，14d出現(xiàn)下降；RA治療組LINGO-1蛋白表達(dá)，在1d和3d時(shí)間點(diǎn)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），在7d和14d 時(shí)間點(diǎn)較模型組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見表3。

3 討論

ICH是臨床常見腦血管病，致死致殘率高。中樞系統(tǒng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)軸突不能再生，最終遺留神經(jīng)功能障礙。而神經(jīng)軸突的再生與髓鞘相關(guān)抑制因子有關(guān)。研究表明[6]：髓鞘相關(guān)抑制因子與勿動(dòng)蛋白受體（Nogo receptor， NgR）復(fù)合物相結(jié)合，激活RhoA激酶，使細(xì)胞骨架發(fā)生動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)而引起神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)錐潰變，從而抑制軸突再生和延長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明[7]：LINGO-1是連接髓鞘抑制信號(hào)與NgR復(fù)合物的紐帶。LINGO-1為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）專有蛋白，高度表達(dá)于CNS神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。LINGO -1的主要功能有以下幾個(gè)方面[8]：（1）抑制軸突再生；（2）抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成；（3）抑制神經(jīng)元存活。在缺血性卒中LINGO-1表達(dá)上調(diào)，而在出血性卒中，LINGO-1表達(dá)是否上調(diào)仍不清楚。本研究結(jié)果顯示ICH后LINGO-1 mRNA表達(dá)于1d開始增加，3d 到達(dá)高峰，7d開始下降，14 d 進(jìn)一步下降。3d前的上升考慮為出血性腦損傷后神經(jīng)元的應(yīng)激反應(yīng)及炎性因子的刺激所致，7d～14d下降考慮為血腫的吸收期，應(yīng)激和炎性因子刺激減少，LINGO -1 mRNA相應(yīng)降低。相對(duì)應(yīng)的LINGO-1 蛋白表達(dá)于1d開始增加，7d到達(dá)高峰，14d的逐漸下降。簡(jiǎn)而言之，在出血周邊區(qū)，LINGO-1的表達(dá)隨血腫的出現(xiàn)上升，隨血腫的吸收出現(xiàn)下降，但仍高于假手術(shù)組。推測(cè)ICH早期特別是3d-7d LINGO-1高水平維持可能是ICH后神經(jīng)再生障礙的原因之一。

RA是脂溶性維生素A的衍生物，是核受體中維甲酸受體（RAR）的配體，并能通過血腦屏障到達(dá)受損的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。Puttagunta等[9]研究證實(shí)RA-RAR通路與NgR復(fù)合體通路在神經(jīng)軸突再生和延長(zhǎng)的直接關(guān)系。CNS受損后，RA和RAR結(jié)合，再與LINGO-1啟動(dòng)子上的維甲酸反應(yīng)成分（ RARE） 結(jié)合，抑制LINGO-1表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，起到改善神經(jīng)功能的作用[9]。在脊髓損傷和缺血性卒中的研究中使用RA治療，均能抑制LINGO-1的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)和神經(jīng)功能的恢復(fù)[10，11]。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，RA治療組神經(jīng)功能Longa評(píng)分在14d出現(xiàn)明顯下降，LINGO-1 mRNA的表達(dá)在7d和14d出現(xiàn)明顯下降，LINGO-1蛋白的表達(dá)亦在14d出現(xiàn)明顯下降，且LINGO-1蛋白水平與Longa評(píng)分行相關(guān)性分析示兩者強(qiáng)相關(guān)。提示RA治療作用可能是通過抑制了LINGO-1mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制RhoA激活，減少RhoA激酶的活化，促進(jìn)腦出血周圍神經(jīng)軸突的再生和延長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善，為RA在ICH中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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