不同鹽度下半滑舌鰨幼魚非特異性免疫酶活力分析＊

房子恒，田相利，董雙林，戴 超，王國棟

（中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003）

鹽度對于魚類的生長及非特異性免疫有顯著影響[1－5]。多數(shù)廣鹽性的硬骨魚類可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的離子含量來適應鹽度大范圍的變化，普遍認為魚類存在一個等滲點，當鹽度超出等滲點時會讓機體消耗更多的能量來維持機體的水鹽平衡[6－7]。有研究表明魚類最多可消耗20%～50%的能量來用于滲透壓的調(diào)節(jié)，也有文獻報道消耗的能量可能只有10%[8]。當水生水生物長期處于高鹽或低鹽脅迫的條件下，往往會引起生物體體質(zhì)下降，并可能導致死亡[9]。通常魚類具有完善的非特異性免疫系統(tǒng)來抵御外界的環(huán)境脅迫，鹽度的變化會對相應的免疫因子產(chǎn)生影響，例如，當魚類長期受到高鹽或低鹽的脅迫時，機體內(nèi)會產(chǎn)生大量的氧自由基并可能導致氧化性的損傷，而抗氧化酶可以有效的清除這些自由基[10]。因此，魚體各組織器官中非特異性免疫酶活力的變化一定程度上可以作為反映魚體對不同鹽度脅迫適應能力的生理指標。

魚類的滲透調(diào)節(jié)是身體各個組織器官包括消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、皮膚、鰓等組織器官協(xié)同作用的結果[11]。其中，鰓及腎臟是魚體中要的滲透壓調(diào)節(jié)器官，當魚體長期處于高于自身等滲點的水體中時，魚體不斷失水同時會攝入大量的鹽分，此時鰓會通過氯細胞向體外排出離子，腎的濾過作用增強，水的重吸收作用也增強，以維持機體細胞內(nèi)的低滲環(huán)境，相反，當魚體進入低滲甚至淡水環(huán)境后，則主要依靠腎臟降低對水分的通透性，排出低滲尿液來維持滲入體內(nèi)水分與排除水分的平衡，同時鰓也可少量的吸收環(huán)境中的離子來維持細胞內(nèi)高滲的環(huán)境[12－13]。而肝臟是魚體重要的新陳代謝器官，參與魚體中抗氧化、糖原合成、分泌膽汁等重要生理過程。因此，當魚體進入非等滲點的環(huán)境時，長期的脅迫必然會導致組織器官的代謝功能發(fā)生改變，導致更多氧自由基及代謝廢物的產(chǎn)生。

半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）主要分布在我國黃海和渤海，是一種典型的海水廣鹽性魚類[14]。由于其味道鮮美、經(jīng)濟價值較高，近幾年來半滑舌鰨逐漸成為我國重要的養(yǎng)殖種類之一。盡管在廣東地區(qū)有低鹽度養(yǎng)殖半滑舌鰨的實踐（鹽度5左右），但一般認為其最適生長鹽度范圍為20～32[15]。目前，有關鹽度對半滑舌鰨生長及生理生態(tài)學的影響已有相關報道[16－17]，不過有關鹽度對半滑舌鰨非特異性免疫能力的研究還未見報道。在目前研究的基礎上，本研究進一步擴大了實驗鹽度的范圍，將半滑舌鰨幼魚生存水體鹽度最低降低至淡水，并延長了半滑舌鰨幼魚在不同鹽度條件下適應的時間，進一步對不同組織中的非特異性免疫酶活力進行了研究，以期豐富半滑舌鰨的生物學資料，為提高半滑舌鰨的海水養(yǎng)殖效率以及開發(fā)淡水養(yǎng)殖提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚的來源、暫養(yǎng)和馴化

實驗所用半滑舌鰨幼魚購自萊州明波水產(chǎn)有限責任公司，挑選規(guī)格較大且個體強壯，活力較強的幼魚。實驗用魚運至中國海洋大學岙山衛(wèi)實驗基地后，暫養(yǎng)于多個水族箱中。暫養(yǎng)期間溫度控制在（21±0.5）℃，24h充氣泵充氧，日換水量100%，光照周期14L∶10D。穩(wěn)定7d后，待其適應實驗室環(huán)境條件后，進一步篩選相近規(guī)格的半滑舌鰨幼魚，開始緩慢馴化至實驗所需鹽度。先以每天鹽度5的速度由鹽度30馴化至鹽度25、20、15，之后以每天鹽度2的速度馴化至鹽度10和淡水，然后在各鹽度下對半滑舌鰨馴養(yǎng)7d，以使其適應新的水環(huán)境條件。低鹽度海水由天然海水（鹽度30左右）與曝氣自來水調(diào)配而成。

1.2 實驗設計和管理

本實驗設置淡水、鹽度5、10、20和30共5個鹽度處理，每個處理設置5個重復，每個重復放置7尾規(guī)格相似、無病健康的半滑舌鰨幼魚。每天7∶00和19∶00投喂配合飼料（廣東越群海洋生物研究開發(fā)有限公司，廣東揭東），30min后收集殘餌，日投喂量為魚體重的3%～5%，其它控制條件同暫養(yǎng)條件。整個實驗于2011年9月28日開始，11月27日結束，實驗時間為60d。

1.3 樣品的采集及酶活的測定

實驗結束后所有幼魚經(jīng)24h饑餓處理后全部稱重取樣，取樣前對幼魚進行MS－222麻醉處理，取其肝臟、肌肉、鰓和腎臟組織放入離心管中，迅速投入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱保存，以上操作在冰盤中進行。所有樣品帶回實驗室后分別測定各組織（肝臟、肌肉、鰓、腎臟）內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活力，過氧化氫酶（CAT）活力、堿性磷酸酶（AKP）活力及酸性磷酸酶（ACP）活力。組織樣品先用剪刀剪碎，準確稱取0.2g于玻璃勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水后勻漿機勻漿，后于 Allegra X－22R 型冷凍離心機3 000r/min離心10min，然后分別稀釋至所需濃度后進行酶活的測定。所有酶活力及蛋白含量（蛋白的測定采用考馬斯亮藍法）的測定均采用南京建成生物研究所提供的試劑盒。

SOD活力采用的是黃嘌呤氧化酶法，1個酶活力單位（U）定義為在37℃水浴下每毫克組織蛋白質(zhì)在1mL反應液中超氧化物歧化酶抑制率達50%時的超氧化物歧化酶量。CAT活力的測定采用紫外比色法，定義在37℃水浴下每毫克組織蛋白每秒分解1mmol的H2O2的量為1個活力單位（U）。AKP活力單位的定義：在37℃水浴下每克組織蛋白與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個酶活力單位（U）。ACP活力單位的定義：在37℃水浴下每克組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1mg酚為1個酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件的方差分析（ANOVA）及Duncan多重比較進行分析處理，以P＜0.05作為差異顯著。

2 結果

2.1 鹽度對半滑舌鰨幼魚生長及存活的影響

不同鹽度下半滑舌鰨幼魚的生長情況見表1。可以看出，淡水組中半滑舌鰨幼魚的生長受到了明顯的抑制（P＜0.05）。到實驗進行到20d時，淡水條件下生長的半滑舌鰨幼魚體重已顯著低于其它處理（P＜0.05）；實驗進行到40d，鹽度10和20下半滑舌鰨幼魚的體重顯著高于其它處理（P＜0.05），以淡水條件下為最低；實驗結束時，半滑舌鰨幼魚末體重在鹽度10和20時較高，顯著高于淡水、鹽度5和30處理（P＜0.05），但鹽度5和30未見顯著差異（P＞0.05）。在整個實驗周期當中無半滑舌鰨幼魚死亡。

2.2 鹽度對半滑舌鰨幼魚不同組織SOD活力的影響

表1 不同鹽度下半滑舌鰨幼魚的生長情況（平均值±標準誤）Table 1 Growth performance of Cynoglossussemiliaevis at different salinities（mean±SE） /g

不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚組織中SOD活力見圖1?？梢钥闯?，肝臟中的SOD在鹽度20時活力顯著高于淡水組（P＜0.05）；而淡水組肌肉中SOD的活力顯著性升高（P＜0.05），其余鹽度條件下活力未見顯著差異（P＞0.05）；在鰓中，鹽度20和30下SOD活力顯著高于淡水、鹽度5和10；腎臟中的SOD活力隨著鹽度的升高總體呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，在鹽度5和10時活力最低，顯著低于淡水及鹽度30處理（P＜0.05）。

圖1 不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚不同組織SOD活力Fig.1 Effect of salinities on the activities of SOD in different tissues of Tongue Sole（mean±SE）

2.3 鹽度對半滑舌鰨幼魚不同組織中CAT活力的影響

不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚組織中CAT活力見圖2?？梢钥闯觯M肝臟中CAT的活力顯著高于其它各組（P＜0.05），鹽度5明顯高于鹽度10，20和30（P＜0.05），鹽度5時顯著高于鹽度10，20和30（P＜0.05），其余處理之間則未見顯著性差異（P＞0.05）；鰓中的CAT活力在鹽度20時最低，顯著低于鹽度30（P＜0.05），其余各處理之間無顯著性差異（P＞0.05）；鹽度對腎臟中的CAT活力影響不顯著（P＞0.05）；在肌肉中未能檢測到CAT活力。

圖2 不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚不同組織CAT活力Fig.2 Effect of salinities on the activities of CAT in different tissues of Tongue Sole（mean±SE）

2.4 鹽度對半滑舌鰨幼魚不同組織中AKP活力的影響

不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚組織中AKP活力見圖3?？梢钥闯觯闻K中AKP的活力隨著鹽度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，鹽度20時活力顯著高于淡水及鹽度5和鹽度30（P＜0.05）；肌肉中AKP的活力隨著鹽度的升高逐漸升高，其中，淡水組中AKP的活力顯著低于鹽度20和鹽度30（P＜0.05）；低鹽度對鰓中AKP的活力有顯著的促進作用，鹽度5和10時鰓中的AKP活力顯著高于鹽度20和30兩個處理（P＜0.05）；腎臟中的AKP活力在淡水和鹽度5時最低（P＜0.05），其余各組之間未見顯著差異（P＞0.05）。

圖3 不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚不同組織AKP活力Fig.3 Effect of salinities on the activities of AKP in different tissues of Tongue Sole（mean±SE）

2.5 鹽度對半滑舌鰨幼魚不同組織中ACP活力的影響

不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚組織中ACP活力見圖4?？梢钥闯?，肝臟中的ACP活力隨著鹽度的升高呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，其中，以淡水條件下活力最高，顯著高于鹽度20和鹽度30處理（P＜0.05）；鹽度對肌肉中ACP活力影響不顯著（P＞0.05）；鰓中ACP的活力隨實驗鹽度的升高呈降低－升高－降低的變化趨勢，其中鹽度5條件下的ACP活力顯著低于淡水和鹽度20條件下的ACP活力（P＜0.05）；腎臟組織在鹽度5時的ACP活力顯著低于淡水和鹽度20、30（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同鹽度對半滑舌鰨幼魚生長的影響

已有研究表明，半滑舌鰨對低鹽度環(huán)境具有極強的耐受性。在鹽度5時半滑舌鰨幼魚仍可以正常的生長，這一結果與本研究相似[18]。半滑舌鰨幼魚對淡水也具有一定的耐受能力。不過，本研究發(fā)現(xiàn)，盡管在淡水條件下半滑舌鰨幼魚沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但其活力卻顯著降低。馴化至淡水的半滑舌鰨幼魚出現(xiàn)了活動減少、對食物的敏感程度下降、易生病等不良反應，其生長也要顯著低于其它鹽度處理。而在鹽度10和20時，半滑舌鰨幼魚的生長率則顯著高于天然海水（鹽度30左右）。相比較，作為廣鹽性種類，大西洋鱈（Gadus morhua）[19]、金頭鯛（Sparussarba）[20]和大菱鲆（Scophthalmusmaximus）[21]等的相關研究也得出了與本研究類似的結果。本研究表明，半滑舌鰨更適宜在10～20鹽度范圍內(nèi)養(yǎng)殖，在此鹽度范圍內(nèi)半滑舌鰨可能更利于其將更多的能量用于生長。

圖4 不同鹽度條件下半滑舌鰨幼魚不同組織ACP活力Fig.4 Effect of salinities on the activities of ACP in different tissues of Tongue Sole（mean±SE）

3.2 不同鹽度對半滑舌鰨幼魚抗氧化酶活力的影響

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是機體內(nèi)重要的抗氧化酶。其中，超氧化物歧化酶的功能是將機體內(nèi)O－歧化成H2O2和O2，而過氧化氫酶可以將H2O2分解為H2O和O2。細胞內(nèi)氧自由基過高，會對細胞內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等造成損傷，導致DNA分子突變，誘發(fā)細胞的衰老死亡，而SOD和CAT二者的協(xié)同作用，可以清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的過量的氧自由基，具有重要保護功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件的變動如水溫、鹽度、溶解氧等均可引起魚體抗氧化酶活性的變化[23]。例如，趙峰等發(fā)現(xiàn)，施氏鱘（Acipenserschrenckiii）心臟、肝臟、脾臟和肌肉組織中的SOD和CAT活力會隨著鹽度的升高表現(xiàn)出不同的變化趨勢[24]。而王曉杰等將許氏平鲉（Sebastesschlegeli）分別馴化至鹽度5和10時，發(fā)現(xiàn)30d后其血液中SOD和CAT活力均出現(xiàn)了明顯的升高[25]。Yin等的研究也發(fā)現(xiàn)銀鯧幼魚（Pampusargenteus）在用低鹽度的海水處理后，其腎臟和肌肉中的SOD和CAT活力大幅度升高[26]。

本研究表明，長期的淡水脅迫對半滑舌鰨幼魚肌肉中SOD和肝臟中CAT的活力具有顯著的促進作用。其中，肝臟中CAT的活力要顯著高于其它組織器官，這可能與肝臟細胞內(nèi)富含過氧化物酶體，是參與體內(nèi)H2O2清除代謝的主要器官有關。長期的淡水脅迫可能會使魚體肝臟內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，而CAT活力的大幅度提高則可以保護肝臟免受損傷。一般來講，肌肉組織在清除活性氧自由基的過程中SOD通常會先發(fā)揮作用[27]，因此在淡水條件下，肌肉中SOD活力大幅度升高。而肌肉中由SOD分解生成的H2O2可能會被最終運送至肝臟內(nèi)分解。這樣，肌肉中SOD和肝臟中CAT活力的提高可以幫助清除魚體中因淡水脅迫而產(chǎn)生的自由基，進而避免機體遭受損傷[28－29]。本研究未在肌肉中檢出CAT活力，表明肌肉中CAT含量可能較低。

鰓和腎臟是魚體重要的滲透調(diào)節(jié)器官。本研究表明，在鹽度5～30范圍內(nèi)鰓SOD活力隨著鹽度的升高逐漸升高，而腎臟在鹽度5和10下則顯著降低。這一結果與點帶石斑魚（Epinephelusmalabaricus）幼魚的相關研究不盡相同。余燕等發(fā)現(xiàn)點帶石斑魚幼魚肌肉和腎臟SOD活力在一定鹽度范圍內(nèi)隨鹽度梯度下降呈上升趨勢[30]。這說明由于種類存在的差異，不同魚類抗氧化酶活性對鹽度適應也存在較大的差異。通常，魚類的鰓組織在滲透壓調(diào)節(jié)過程中起到排出體內(nèi)多余離子的作用，而腎臟則主要起到排除多余水分的作用，當魚類由海水進入淡水后，適應于低滲環(huán)境的生理機制啟動，腎臟的代謝壓力會逐漸增大[31－32]。

3.3 不同鹽度對半滑舌鰨幼魚磷酸酶活力的影響

根據(jù)pH特性，磷酸酶有堿性磷酸酶和酸性磷酸酶之分。它們通過調(diào)節(jié)蛋白（酶）的去磷酸化過程，參與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運輸過程，同時也構成了生物體內(nèi)重要的解毒體系[26]。本研究結果顯示，在淡水至鹽度20范圍內(nèi)，半滑舌鰨幼魚肝臟、肌肉和腎臟中AKP活力也隨鹽度的升高而逐漸升高，而鰓中則以鹽度5和10下為最高。與此比較，馮娟等對軍曹魚（RachycentroncanadumLinnaeus）在鹽度5～37時血清中AKP活性的變化時則發(fā)現(xiàn)血清中的AKP活力隨鹽度的升高不斷升高[34]，而劉存岐、白秀娟等的研究則表明，海水中的金屬離子含量的升高對于磷酸酶活性具有顯著的促進作用[35－36]，這些結果與本研究相似。推測可能在一定鹽度范圍內(nèi)，鹽離子濃度的增加對于半滑舌鰨部分組織AKP活力可能具有一定的促進作用。在淡水條件下，半滑舌鰨肝臟中的ACP活力始終處于較高的水平，顯著高于對照鹽度30下水平，但肌肉、鰓和腎臟中ACP活力水平與對照鹽度30下水平差異不大，表明淡水馴化對于上述3個組織中ACP活力影響不大。一般來講，淡水組中肝臟ACP活力較高，一方面可能在于由于幼魚受到長期脅迫肝臟增強代謝提高機體能量供應有關，另一方面，魚類ACP一般在機體感染初期的非特異性免疫保護中起重要作用[37]，可能長期的淡水脅迫導致魚體免疫力降低，導致機體應對病原菌入侵而產(chǎn)生相應的反應。值得注意的是，與其它鹽度比較，作為滲透調(diào)節(jié)器官，半滑舌鰨鰓和腎臟組織在鹽度5下呈現(xiàn)出了較低的ACP活力，與其SOD活力反應相似，這一現(xiàn)象目前尚難以解釋，其中的機制尚需進一步研究。

3.4 關于半滑舌鰨幼魚對不同鹽度的適應性

本研究結果表明，半滑舌鰨幼魚對于低鹽度具有很強的適應能力，生產(chǎn)中可適當?shù)慕档秃Ｋ柠}度以促進半滑舌鰨的生長，其最適的生長鹽度范圍可能在10～20之間。鹽度對于半滑舌鰨幼魚不同組織非特異性免疫酶的影響存在明顯的組織特異性，這可能與半滑舌鰨幼魚不同器官組織生理功能的不同有關。例如，肝臟作為魚體重要的代謝器官，主要參與魚體的生長及能量代謝?？梢钥闯?，肝臟內(nèi)SOD在鹽度20時活力最高，可能與鹽度20時肝臟生長及合成代謝最為旺盛有關。代謝旺盛的魚類肝臟可以儲存和合成大量的脂肪，而脂肪酸的氧化則會導致自由基的生成[38－40]。肝臟中AKP的活力也在鹽度20時活力最高，這可能與AKP參與肝臟中營養(yǎng)物質(zhì)的消化運輸有關?？傮w上看，在鹽度5以上時半滑舌鰨幼魚的非特異性免疫能力與對照相比基本維持在正常的水平，而淡水條件下半滑舌鰨的多項生理指標則出現(xiàn)了異常，表明淡水條件對半滑舌鰨幼魚可能產(chǎn)生了較強的脅迫作用，影響了其正常的生理過程，進而對其生長產(chǎn)生了負面影響。本研究過程中也觀察到，淡水組半滑舌鰨幼魚活動減少，對食物的敏感程度下降，生長速度顯著下降。不過，通常個體較大的魚對鹽度的適應能力會較強[41]，鑒于本研究使用的魚規(guī)格較小，因此今后還需要采用較大規(guī)格的半滑舌鰨進行相關試驗，以進一步確認不同規(guī)格的半滑舌鰨對鹽度的適應能力。

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