定量蛋白組學技術在篩選急性主動脈夾層早期診斷標志物中的研究進展

買吐地·買吐遜，馬翔

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院冠心病二科，烏魯木齊 830054)

急性主動脈夾層(acute aortic dissection，AAD)是一種發(fā)病急、進展快、病死率高、嚴重危及生命的急危癥，在急性發(fā)病后24 h內，每小時死亡風險增加1%[1]。盡早準確診斷并及時采取適當?shù)闹委煷胧┛娠@著降低AAD的病死率，改善遠期預后，但由于AAD癥狀、體征復雜多變，往往很難與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、肺栓塞、急腹癥等疾病早期鑒別[2]。目前AAD主要依靠C反應蛋白、D-二聚體、全主動脈CT血管造影(computed tomography angiography，CTA)及主動脈數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)等檢查診斷。其中CTA和DSA是目前AAD診斷的金標準，但DSA耗時長，有一定的創(chuàng)傷性，因此不作為AAD的常規(guī)檢查手段。由于無創(chuàng)、診斷準確率高等優(yōu)點，主動脈CTA一般作為AAD首選檢查手段，但該檢查耗時也較長，可能延誤病情，故不適用于病情不穩(wěn)定的AAD患者[3]。由于缺乏靈敏度、特異度高的早期診斷標志物，AAD快速診斷困難，因此篩選用于臨床的早期診斷AAD診斷標志物，對防止患者病情進展具有重要意義[4-5]。蛋白組學是蛋白質與基因組學的結合，對基因組表達的絕大多數(shù)蛋白質進行精確的定量和鑒定，目前該技術主要常規(guī)用于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物的研究中[6]。定量蛋白組學是蛋白組學技術的重要分支，被用來定量和識別基因組或復雜混合物中表達的所有蛋白質[7-8]。現(xiàn)就定量蛋白組學技術在篩選AAD早期診斷生物標志物中的應用價值予以綜述。

1 定量蛋白組學技術的分類

1.1同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術 iTRAQ技術是由美國ABI公司研發(fā)的多肽體外標記定量蛋白組學技術，該技術樣本兼容性好，既可相對定量也可絕對定量，可同時對8組樣本進行定性、定量比較，具有蛋白通量高、覆蓋度高、自動化程度高等優(yōu)點[9]。用于臨床研究15年來，iTRAQ技術在國內外深受歡迎，目前應用iTRAQ試劑對血清、血漿、組織等樣本進行高通量的液相二級質譜分析，獲得一些對疾病有早期診斷價值的候選生物標志物，可為主動脈夾層、肝癌、前列腺癌、肺癌及乳腺癌等疾病的早期診斷、預后評估提供很大的幫助[10-11]。

1.2串聯(lián)質量標簽(tandem mass tag，TMT)技術 TMT標記是一種采用6-plex或10-plex同位素的標簽進行串聯(lián)質譜分析的多肽體外標記蛋白組學技術。TMT技術能同時比較2組、6組或10組不同樣品中蛋白質的相對含量，具有較好的平行性，能避免技術誤差，檢測的樣本可以多路復用，并可以創(chuàng)建具有高精度和最小缺失值的大規(guī)模數(shù)據(jù)集，提高差異蛋白檢測效率[12]。與凝膠方法相比，應用TMT技術可以發(fā)現(xiàn)膜蛋白、核蛋白及胞外蛋白，對低豐度蛋白質亦有較好的檢出率[11]。TMT技術目前在國內外廣泛應用于篩選腹主動脈瘤、胰腺癌、乳腺癌等疾病生物標志物的研究中，篩選出了具有臨床應用價值的生物標志物，為疾病的研究提供了新的方法和思路[12-13]。

1.3非標記定量(Label-free)技術 Label-free定量蛋白組學是一種不依賴于同位素標記的多功能新型定量蛋白組學技術，通過液質聯(lián)用對蛋白質酶解肽段進行分析，與iTRAQ、TMT技術相比，Label-free技術不需要穩(wěn)定同位素標簽作為內部標準，通過分析鑒定蛋白質時所產生的質譜分析次數(shù)或質譜峰強度比較不同樣本中相應肽段的信號強度，就能估計不同樣品之間蛋白質豐度的變化，對相應的蛋白質進行相對定量分析；Label-free技術目前已成為臨床上用于篩選生物學標志物研究的高通量定量蛋白組學方法之一[14]。在所有用于差異化肽段定量分析的技術中，Label-free技術提供了最高的靈活性，并且由于軟件和硬件設備的最新進展、更新，其使用范圍越來越廣，準確率也在不斷提高[15-16]。與傳統(tǒng)的3D-Label-free技術相比，新一代4D-Label-free蛋白組學技術在檢測通量、深度、準確率方面同時獲得了巨大的提升，可提供更高速度、更高靈敏度、更強大的分析性能，為蛋白組學與修飾組學分析帶來了更高的靈敏度和速度[17]。

1.4細胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技術 SILAC是通過細胞培養(yǎng)物中的氨基酸進行穩(wěn)定同位素標記的高通量蛋白測序的一種蛋白組學技術[18]。SILAC技術屬于體內標記，標記效率高且穩(wěn)定，無細胞毒性，樣品無需預處理，不僅適用于進行全細胞蛋白質的分析，也適用于膜蛋白的鑒定和定量分析，其多功能性可以擴展到產生細胞內的標準來量化組織中低豐度的蛋白質，稱為Super SILAC[19]。SILAC技術自2002年推出以來，就成為化學家和細胞生物學家進行生物學研究的常規(guī)方法以及定量蛋白組學研究、系統(tǒng)生物學研究的重要工具，廣泛用于發(fā)現(xiàn)血漿生物標志物的研究中[20]。SILAC技術能夠清楚地鑒定和量化在腫瘤發(fā)生中必不可少的蛋白質動力學，因此已廣泛用于癌癥蛋白組學的研究。例如，基于SILAC的質譜儀進行的全球蛋白組學分析提供了與乳腺腫瘤進展相關的蛋白質變化以及新的預后標志物信息；基于SILAC的定量蛋白組學的應用可以對人癌細胞間期和有絲分裂之間的表面蛋白質組進行詳細評估，從而為抗有絲分裂的癌癥化療提供潛在的藥效生物標記[21]。

1.5雙向差異凝膠電泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)技術 2D-DIGE是基于二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，D-PAGE)技術的定量蛋白組學技術，其分辨率和靈敏度高，變異性低，可以對樣本間蛋白質豐度差異進行精確分析[22]。與傳統(tǒng)的2D-PAGE技術相比，2D-DIGE技術中不同的樣品分別用不同的熒光染料標記、混合，然后通過2D-PAGE分離，最后使用激光掃描儀對凝膠成像，因此2D-DIGE技術克服了凝膠間差異；此外2D-DIGE通過取消耗時的凝膠染色步驟提高了通量效率[23]。2D-DIGE技術具有可重復性、全面性、高通量等優(yōu)點，提供了更快、更可靠的凝膠匹配，可精確地檢測1 ng范圍內的蛋白質含量，是目前廣泛用于篩選肺癌、乳腺癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病早期診斷生物候選標志物及預測患者預后的常用工具，有助于促進精密醫(yī)學的發(fā)展[24-25]。

1.6數(shù)據(jù)非依賴采集(data independent acquisition，DIA)技術 DIA技術是一種新穎、全息式定量蛋白組學技術，開啟了高通量、全面定量蛋白組學的新領域，有效解決了鳥槍法、數(shù)據(jù)依賴性采集以及選擇性反應監(jiān)測技術存在的低豐度肽段信息丟失、重現(xiàn)性不佳、定量分析準確率不高等不足[26]。DIA技術操作流程簡單有效，具有使用范圍廣、蛋白定量能力強、鑒定出的肽段和蛋白質的數(shù)量全面、無同位素標記要求、監(jiān)測成本低等優(yōu)點，可以對數(shù)千種蛋白質進行定量分析，提高了差異蛋白檢測特異性，使檢測蛋白缺失值更少[27]。DIA技術在目標蛋白組學領域具有廣闊的應用前景，目前在診斷試驗、疾病預后評估及候選生物標志物篩選研究中常規(guī)使用[28]。

1.7平行反應監(jiān)測(parallel reaction monitoring，PRM)技術 PRM是一種以四極桿-高分辨質譜平臺、基于高精度質譜的靶向蛋白組學技術，能夠對目標蛋白質進行選擇性檢測，從而實現(xiàn)對目標蛋白質的絕對定量[29]。PRM技術是相對于傳統(tǒng)選擇性反應監(jiān)測技術建立起來的高分辨監(jiān)測技術，目前被認為是質譜定量的金標準，與蛋白免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫組織化學等傳統(tǒng)的檢測驗證方法相比，PRM驗證具有靈敏度和特異度高、高通量(一次可檢測數(shù)10種蛋白)、準確率高、不依賴抗體、所需實驗周期短等優(yōu)點，在臨床生物標志物的篩選研究中被廣泛應用，是目前目標蛋白驗證的主流方法[30]。隨著蛋白組學技術的進一步進展，可以預見未來PRM技術的應用范圍將進一步拓展，進而取代低分辨率的目標蛋白檢測及驗證技術[31]。

2 定量蛋白組學技術在篩選AAD早期診斷標志物中的應用

2.1iTRAQ技術與AAD 既往有研究報道，用iTRAQ技術對主動脈瘤患者血漿標本進行高通量篩選以尋找主動脈瘤早期診斷生物標志物[32]；Zhang等[33]使用iTRAQ技術對Stanford A型AAD患者和行冠狀動脈旁路移植術的冠心病患者的升主動脈組織標本進行差異蛋白篩查，以尋找AAD患者早期診斷生物標志物，結果顯示，相對于冠心病對照組，Stanford A型AAD組中共篩選出36種顯著差異表達蛋白，其中19種蛋白表達水平顯著下調，17種蛋白表達水平顯著上調，差異表達率超過1.5倍(>1.5或<0.66)；他們用蛋白免疫印跡法進一步驗證Fibrillin-1、Emilin-1、Decorin、DJ-1和Histone H4 5種差異蛋白在上述兩類升主動脈平滑肌細胞中的表達水平，結果表明，與轉化生長因子-β信號轉導相互作用的Fibrillin-1、Emilin-1和Decorin三種重要蛋白通過轉化生長因子-β信號通路導致細胞外基質重塑，可能參與AAD的形成。Xiao等[34]用iTRAQ技術分析AAD患者和健康對照組的血清樣品，結果顯示，164種蛋白達到定量標準，其中64種上調蛋白和61種下調蛋白差異表達率超過1.2倍；進一步擴大樣本量，用AAD患者和表現(xiàn)為急性胸痛的非AAD患者血清標本驗證上述差異蛋白，并選擇差異表達率高的Lumican蛋白、C反應蛋白、血小板反應蛋白-1及D-二聚體作為候選生物標志物，探討這些候選生物標志物對AAD的診斷價值，結果顯示，AAD組中D-二聚體、Lumican的表達水平顯著高于對照組；為了分析驗證診斷試驗的準確性，繪制了受試者工作特性曲線，Lumican和D-二聚體曲線下面積分別為0.895和0.891；采用Lumican和D-二聚體對AAD聯(lián)合診斷，靈敏度為88.33%，特異度為95%；這些結果表明，Lumican和D-二聚體聯(lián)合檢測可以優(yōu)化AAD診斷的靈敏度和特異度，能有效提高AAD早期診斷的靈敏度和準確率。另外，Gu等[5]用iTRAQ技術鑒定AAD的潛在血清生物標志物，將研究對象分為AAD組、AMI組和健康志愿組，從三組中收集血清樣本用于iTRAQ分析，結果發(fā)現(xiàn)，相對于AMI組和健康志愿組，AAD組共鑒定出174種顯著差異表達蛋白，其中46種蛋白差異表達率超過2倍；基于上述iTRAQ發(fā)現(xiàn)，他們選擇了可能與血管損傷相關的Fibronectin蛋白和Lumican蛋白，用AAD和正常對照組血清對上述兩種蛋白進行ELISA驗證，ELISA初步分析發(fā)現(xiàn)，AAD組與對照組中Lumican蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，而兩組間Fibronectin蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.685)；再進一步擴大樣本量，用血清樣品對Lumican蛋白進行ELISA驗證，結果顯示，相對于正常對照組和AMI組，AAD組Lumican蛋白水平顯著增加，表明基于iTRAQ技術發(fā)現(xiàn)的Lumican蛋白是一種潛在的診斷標志物，可能有助于AAD的早期診斷。

2.2Label-free技術與AAD 近年來，Label-free技術廣泛用于蛋白組學研究，有效提高了結腸癌、肺癌、乳腺癌等疾病診斷的準確率，極大地縮短了疾病診斷時間，為盡早精確診療提供了幫助[15]。王河清等[35]收集AAD患者和健康人血清各3份，進行Label-free檢測，共鑒定出648種蛋白，通過t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析[認定蛋白差異倍數(shù)>4.00或<0.25(P<0.05)為差異顯著的蛋白]，得到了12種顯著差異表達的蛋白，其中紐蛋白的差異表達率顯著高于其他蛋白，并將紐蛋白設為夾層撕裂時主動脈壁釋放出的特異性蛋白，因此紐蛋白被選為該研究的目標蛋白；進一步收集AAD患者、AMI患者和健康人血清各9份，對紐蛋白進行ELISA驗證，同時收集AAD患者升主動脈組織進行免疫組織化學檢測；ELISA驗證結果表明，AAD組與AMI組和健康對照組相比紐蛋白水平并沒有升高，而免疫組織化學結果發(fā)現(xiàn)，主動脈發(fā)生撕裂位置的紐蛋白分布較未發(fā)生撕裂位置密集，表明紐蛋白可能參與AAD的發(fā)病過程，是一種具有研究價值的AAD潛在生物標志物。

2.3PRM技術與AAD 馬方綜合征是由原纖蛋白-1基因突變引起的遺傳性結締組織疾病，有胸主動脈瘤和胸主動脈夾層發(fā)生的風險，且胸主動脈瘤破裂或胸主動脈夾層是馬方綜合征的主要死亡原因。Yin等[36]用質譜方法分析了胸主動脈瘤合并馬方綜合征組與胸主動脈瘤未合并馬方綜合征組患者的細胞外基質糖蛋白水平，并通過PRM技術對糖蛋白進行定量分析，首次證明了馬方綜合征患者中存在與原纖蛋白-1相互作用的微原纖維相關蛋白4(microfibril-associated glycoprotein 4，MFAP4)的異常糖基化，且合并馬方綜合征的主動脈瘤患者MFAP4糖基化作用較未合并馬方綜合征的動脈瘤患者顯著增強；MFAP4在馬方綜合征患者的主動脈血管壁中表達豐富，其信使RNA水平在馬方綜合征患者升主動脈中顯著升高，且高MFAP4血漿水平患者隨訪期間發(fā)生了Stanford B型主動脈夾層。證明MFAP4是一種有希望的候選血漿生物標志物，可用于識別發(fā)生Stanford B型AAD風險較高的馬方綜合征患者，對發(fā)生Stanford B型AAD風險較高的馬方綜合征患者進行更密切的監(jiān)測以避免AAD的發(fā)生。

3 小 結

AAD是一種非常兇險的心血管疾病，由于缺乏快速、準確的檢測手段，經常會貽誤病情，失去最佳治療時間窗，導致高病死率，對人類健康構成嚴重威脅。理想的生物標志物應具備非常高的靈敏度和特異度，且使用方便、安全、經濟。目前對于AAD的快速診斷尚無可用于臨床的理想生物標志物。通過定量蛋白組學已經篩選出許多AAD生物標志物候選物，但還未應用于臨床。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，PRM、DIA、4D Label-free等新型定量蛋白組學技術將逐漸取代傳統(tǒng)質譜技術，越來越多地應用于臨床研究，使AAD生物標志物開發(fā)的效率及實用性進一步提高，篩選出具有高靈敏度、高特異度以及具有實際診斷應用價值的標志物，實現(xiàn)AAD的快速早期診斷，使AAD患者得到及時的治療，降低病死率。