凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)造血激素的組織分布及細(xì)胞定位分析*

徐萌霖 梁 艷 盧金鳳 王曉雯李 晨 邢 婧 黃 倢

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凡納濱對蝦()造血激素的組織分布及細(xì)胞定位分析*

徐萌霖1, 2梁 艷2盧金鳳2王曉雯1, 2李 晨2邢 婧1黃 倢2①

(1. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003; 2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)院研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

造血激素(astakine)是一種具有促進(jìn)造血組織細(xì)胞分化和增殖作用的甲殼動物細(xì)胞因子, 參與甲殼動物的造血活動, 對于只依賴于非特異性免疫的甲殼動物抗感染能力有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室前期成功克隆凡納濱對蝦造血激素(LvAST)的基因Lvast。為了進(jìn)一步了解其功能, 本文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了Lvast表達(dá)的組織分布, 同時(shí)還用Dlight標(biāo)記抗LvAST抗體進(jìn)行了LvAST在對蝦細(xì)胞和組織中的免疫熒光定位分析。熒光定量PCR測定結(jié)果說明, Lvast主要在肝胰腺、鰓和肌肉中大量表達(dá), 而淋巴器官和血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量較低; 免疫熒光結(jié)果顯示, LvAST可同時(shí)存在于血淋巴細(xì)胞內(nèi)和血淋巴細(xì)胞膜表面, 不同的血淋巴細(xì)胞表面的LvAST分布呈現(xiàn)出明顯差異, 可能具有重要的血細(xì)胞分類意義。LvAST蛋白在肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官等組織中均有分布, 并且肝胰腺組織中分布較多, 淋巴器官組織中分布較少。

凡納濱對蝦; 造血激素; 熒光定量PCR; 激光共聚焦顯微鏡; 熒光定位

蝦類等無脊椎動物沒有抗體和特異性免疫功能, 缺少脊椎動物獲得性免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性和記憶能力, 它們的免疫防御功能主要依賴于先天的非特異免疫機(jī)制(Lorenzon, 1999; Philippe, 1999)。雖然如此, 甲殼動物的先天免疫系統(tǒng)仍然是高度發(fā)展的, 其發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞和體液依賴血液的循環(huán)作用散布于身體的多種組織, 其對外源侵染的反應(yīng)非常高效而復(fù)雜(Smith, 1991)。當(dāng)甲殼動物的機(jī)體受到體內(nèi)外刺激后, 游離的血細(xì)胞數(shù)量會急劇下降(Lorenzon, 1999), 而新的血細(xì)胞的補(bǔ)充對于維持甲殼類動物生理機(jī)能的穩(wěn)定十分關(guān)鍵(Johansson, 2000)。近年研究發(fā)現(xiàn)了一種類細(xì)胞因子的造血激素(Astakine, AST), 這是一種具有促進(jìn)造血組織細(xì)胞分化和增殖的甲殼動物細(xì)胞因子(Lin, 2009, 2011; 梁高峰等, 2012), 這種造血激素極有可能在蝦的免疫防御反應(yīng)中起到重要作用。

AST最早由Lin等在軟尾太平蝲蛄()中發(fā)現(xiàn), 隨后斑節(jié)對蝦()造血激素和凡納濱對蝦()造血激素(LvAST)的cDNA序列也相繼被克隆出來(Hsiao, 2010; 梁高峰等, 2012)。LvAST的序列中包含一個(gè)脊椎動物前動力蛋白(Prokineticin, PK)功能域, PK是一類存在于脊椎動物中的分泌蛋白(Hsiao, 2010), 其在多種組織中均有分布。該蛋白在脊椎動物中具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用, 在血管生成、創(chuàng)傷感應(yīng)、晝夜節(jié)律控制等行為的調(diào)制等方面具有重要作用(Melchiorri, 2001; Ng, 2005; Matsumoto, 2006)。但是LvAST的N-端沒有PK蛋白中保守的AVITGA, 因此LvAST的功能可能與PK蛋白的功能有所差別(梁高峰, 2011)。S?derh?ll等(2005)和Watthanasurorot等(2011)證實(shí)AST參與到造血作用中并且對于調(diào)節(jié)無脊椎動物的晝夜節(jié)律有重要作用。另外本實(shí)驗(yàn)室前期研究中表明, AST對于白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)有一定程度的抑制作用(梁高峰, 2011)1)。而Lin等(2009)通過多種實(shí)驗(yàn)方法證明F1F0-ATP合酶β亞基是造血激素的一個(gè)受體。本實(shí)驗(yàn)前期研究中也發(fā)現(xiàn)F1F0-ATP合酶β亞基具有和LvAST相同的組織和細(xì)胞分布。

目前對于AST的研究仍然很少, 本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光技術(shù)對凡納濱對蝦AST蛋白在細(xì)胞和組織上進(jìn)行定位, 為進(jìn)一步了解AST的生物學(xué)功能和豐富凡納濱對蝦基礎(chǔ)研究資料提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對蝦

凡納濱對蝦()活體于2011年4月購自青島南山市場, 體長8—10cm, 經(jīng)PCR檢測無WSSV, 在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3d。

1.2 抗體及其熒光素標(biāo)記

將本實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)的LvAST(梁高峰, 2011)委托GenSript公司(美國)制備成兔抗LvAST多克隆抗體, 經(jīng)過抗原抗體吸附法進(jìn)行純化后經(jīng)間接ELISA法測定其滴度為1∶3000。分別將100μL兔抗LvAST多抗和100μL 2.5g/mL BSA(Sigma公司)加入到50μg Dlight 649-NHS熒光素粉末(Themor, 美國)中; 同時(shí), 分別將100μL兔陰性血清和100μL兔抗β-actin單克隆抗體(1∶500, Proteintech公司, 美國)加入到50μg Dlight 488-NHS熒光素(Themor, 美國), 各在室溫下連接1h后, 于4°C在PBS (8g/L NaCl 8g, 2.9g/L Na2HPO4·12H2O, 0.2g/L KCl, 0.2g/L KH2PO4, pH 7.4)中透析過夜, 除去未標(biāo)記上的熒光素。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

從3尾凡納濱對蝦腹節(jié)血竇取血淋巴并混合, 同時(shí)分別取對蝦的鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官組織, 加入1mL TRIzol試劑(Invitrogen, 美國), 按照試劑所附操作方法提取總RNA。對所得到的RNA分別用無RNase的DNase I (上海生工生物工程有限公司)消化, 以O(shè)ligo(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物, 使用Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒(Transgen公司, 德國), 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以合成的cDNA為模板, 根據(jù)序列(GenBank: HM594944), 用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)vast-F和Lvast-R(表1), 以β-actin作為內(nèi)參基因, 使用Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒(Roche公司, 德國), 在Rotor Gene 3000熒光定量PCR儀(Corbett Research公司, 澳大利亞)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定。操作方法參照說明書, 25μL反應(yīng)體系中含模板cDNA 1.0μL, 10μmol/L引物0.5μL, 2× qPCR Super Mix 12.5μL, DyII 0.5μL。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性10 s; 45個(gè)循環(huán)的95°C變性15 s, 57°C退火10 s, 72°C延伸15 s; 72°C延伸10 min。使用Rotor-Gene6軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物及其序列

Tab.1 Primers used in the experiments

1.5 對蝦血淋巴細(xì)胞原代培養(yǎng)

取3尾凡納濱對蝦, 用75%酒精消毒體表, 用無菌注射器從對蝦腹節(jié)血竇抽取血淋巴(注射器內(nèi)預(yù)先抽取等體積抗凝劑: 450mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl, 10mmol/L EDTA, 10mmol/L HEPES, pH 7.45), 于100×離心10min, 收集細(xì)胞沉淀, 用2×L15培養(yǎng)基(含19%胎牛血清, 100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)重懸, 混勻后加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 28°C培養(yǎng)2h。

1.6 石蠟組織切片的制備

向活凡納濱對蝦的肝胰腺部位分多點(diǎn)注射1mL Davidson’s AFA固定液(Lightner, 1988), 取出肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官組織, 分別放入10倍體積的固定液中固定8h, 按對蝦組織學(xué)手冊的方法制備石蠟切片, 每張載玻片放置4塊切片, 展片后進(jìn)行后續(xù)熒光定位實(shí)驗(yàn)。

1.7 LvAST在血淋巴細(xì)胞上定位

取出貼壁生長良好的血淋巴細(xì)胞, 倒去培養(yǎng)基, 2×PBS輕輕洗滌2次, 每次3min, 分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。其中實(shí)驗(yàn)組A和B用無水乙醇處理3min以增加細(xì)胞膜通透性; 實(shí)驗(yàn)組C、D血淋巴細(xì)胞不進(jìn)行處理。2×PBS洗滌后用10% BSA(溶于PBS中)37°C封閉1h, 去除封閉液后, 在A和C組細(xì)胞中加入1∶1的Dylight 649標(biāo)記的兔抗LvAST多抗和1∶1 Dylight 488標(biāo)記的兔抗β-actin單抗, B和D組加入Dylight488標(biāo)記的免疫前兔血清和Dylight 649標(biāo)記的BSA作為陰性對照, 37°C避光孵育2h。2×PBS洗滌后, 用300nmol/L DAPI (溶于2×PBS中)復(fù)染3min, 用激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)觀察。

1.8 LvAST在肝胰腺、肌肉、鰓、淋巴器官石蠟切片上的定位

取肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官石蠟切片各一張, 按照對蝦組織學(xué)手冊的方法脫蠟后PBS洗2×5min; 放入100mL 10mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0), 用微波爐高火加熱至沸騰, 室溫下放置10min后再次加熱至沸騰, 待溫度降為室溫后PBS漂洗3×5min; 加10% BSA(溶于PBS中)室溫封閉1h, PBS漂洗3×5min; 切片用基因芯片圍欄(博奧生物有限公司, 北京)隔成A、B兩部分。在各切片圍欄A部分樣品上加入200μL 1∶1 Dylight 649標(biāo)記的LvAST多克隆抗體, 各切片圍欄B部分加入等體積的Dylight 488標(biāo)記的免疫前兔血清, 室溫孵育1h, PBS洗滌后, 加DAPI核染3min, 漂洗后50%甘油封片, 在激光共聚焦顯微鏡下(Nikon A1R, 日本)觀察。

1.9 激光共聚焦顯微觀察

分別以激發(fā)光488nm(觀察Dylight 488在518nm的綠色熒光)、425nm(觀察DAPI在461nm的藍(lán)色熒光)、654nm(觀察Dylight 649在673nm的紅色熒光)在激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)下觀察并照相。觀察時(shí)采用20×物鏡, 應(yīng)用NIS軟件進(jìn)行圖像分析。

1.10 熒光顯微照片熒光強(qiáng)度的定量分析

應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)自帶NIS軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析, 記錄每張照片的激發(fā)光強(qiáng)度(Laser power, LP)和照相時(shí)的發(fā)射光增益(PMT Gain, PG): 利用軟件求出選定區(qū)域內(nèi)所有顏色熒光的輪廓所覆蓋的面積(AF)和該區(qū)域內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度(R), 則LvAST在單位重量的組織中的相對量(LvAST)按以下公式計(jì)算。

LvAST=R/ (AF·LP·PG)

2 結(jié)果

2.1 Lvast mRNA在各組織中的特異性表達(dá)

凡納濱對蝦鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官、血淋巴5種組織經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對和β-actin的mRNA進(jìn)行分析, 檢測到這5種組織中均有mRNA 的表達(dá)。擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量溶解曲線為單峰, 表明不存在非特異擴(kuò)增及引物二聚體。根據(jù)Rotor-Gene 6軟件采用ΔΔCT方法對結(jié)果進(jìn)行分析, 以肌肉組織作為校正樣品(Calibrator), 濃度定為1, 比較不同組織中在凡納濱對蝦組織中的表達(dá)(圖1)。結(jié)果表明mRNA在所檢測的鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官、血淋巴中的表達(dá)差異很大, 其中肝胰腺、肌肉和鰓中表達(dá)量最高。

圖1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對對蝦不同組織中Lvast mRNA表達(dá)的定量分析

注: 縱坐標(biāo)的相對表達(dá)量為ΔΔCT相對定量分析(以β-actin為內(nèi)參基因)

2.2 LvAST在血細(xì)胞上的免疫熒光定位

凡納濱對蝦血淋巴細(xì)胞用無水乙醇破壞細(xì)胞膜的通透性后(實(shí)驗(yàn)組A), 與綠色熒光素(Dylight 488)標(biāo)記的抗β-actin抗體孵育, 在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出大量細(xì)胞骨架蛋白β-actin的陽性信號(綠色熒光)(圖2c), 同時(shí)經(jīng)紅色熒光素Dylight 649標(biāo)記的抗LvAST抗體染色后, 細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量帶狀或點(diǎn)狀的紅色熒光(圖2c), 這種紅色熒光幾乎在所有的細(xì)胞中均能看到, 不過不同細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度有明顯差異; 未經(jīng)無水乙醇處理的血淋巴細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組B), 與熒光標(biāo)記的抗β-actin抗體和抗LvAST抗體孵育后, 未觀察到β-actin的陽性信號, 但部分血淋巴細(xì)胞依然可以觀察到明顯的LvAST的紅色熒光, 而部分細(xì)胞幾乎沒有或只有很少的點(diǎn)狀分布的紅色熒光(圖2a); 免疫前血清孵育的陰性對照組未觀察到綠色和紅色熒光信號(圖2d)。上述結(jié)果表明LvAST可分布在血淋巴細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜表面, 但在不同血淋巴細(xì)胞表面的分布似乎有明顯的差異。

2.3 LvAST的熒光免疫組織化學(xué)染色定位

采用免疫熒光組織化學(xué)染色的方法對LvAST進(jìn)行定位。用紅色熒光素DyLight 649標(biāo)記的抗LvAST多克隆抗體對對蝦肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官的石蠟切片染色后, 經(jīng)654nm外源性激發(fā)光激發(fā), LvAST染色呈紅色熒光, 從圖3中可以看出LvAST在肝胰腺、肌肉、鰓、淋巴器官中均有分布(圖3a, 3c, 3e, 3g)。細(xì)胞核染色后呈藍(lán)色, 陰性對照(圖3b, 3d, 3f, 3h)無明顯熒光信號。

圖2 激光共聚焦顯微鏡下免疫熒光細(xì)胞染色

a: 未經(jīng)乙醇處理的血淋巴細(xì)胞用抗LvAST熒光抗體和抗β-actin熒光抗體染色, b: 未經(jīng)乙醇處理的血淋巴細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記BSA和陰性血清染色的陰性對照, c: 乙醇處理的血淋巴細(xì)胞用抗LvAST熒光抗體和抗β-actin熒光抗體染色, d: 乙醇處理的血淋巴細(xì)胞用熒光標(biāo)記的BSA和陰性血清染色的陰性對照

2.4 顯微照片熒光強(qiáng)度的相對定量分析

應(yīng)用NIS軟件獲得視野中所有顯示紅色或藍(lán)色熒光的組織中的紅色熒光的平均熒光強(qiáng)度, 結(jié)合相應(yīng)照片的增益和激發(fā)光強(qiáng)度, 求出單位面積組織中的紅色熒光強(qiáng)度即為LvAST在組織中的相對量(圖2)。結(jié)果顯示, LvAST在肝胰腺中分布最多, 在淋巴器官中分布最少, LvAST蛋白不同組織的分布結(jié)果與熒光定量PCR所得的mRNA在不同組織中特異性表達(dá)的結(jié)果相近, 但由于前者為蛋白水平后者為mRNA水平, 存在蛋白翻譯水平的調(diào)控, 因此存在少許差異。不經(jīng)乙醇處理和經(jīng)過乙醇處理的血淋巴細(xì)胞經(jīng)熒光免疫染色后的熒光定量分析, 結(jié)果表明LvAST在血淋巴細(xì)胞表面的分布是LvAST在血淋巴細(xì)胞內(nèi)及其表面總量的50%。

3 討論

WSSV是對蝦大規(guī)模死亡的主要病原, 具有高致死率和廣宿主嗜性, 自爆發(fā)以來對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。WSSV可感染對蝦甲殼下上皮組織、血淋巴細(xì)胞、結(jié)締組織、造血組織、鰓、肝胰腺管間血竇和淋巴器官細(xì)胞(雷志文等, 2002), 本實(shí)驗(yàn)室前期通過養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)分析LvAST對凡納濱對蝦抗WSSV感染的影響證明LvAST能在一定程度上提高對蝦抗WSSV感染的能力, 起到保護(hù)作用(梁高峰, 2011)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下LvAST的免疫熒光組織化學(xué)染色

a: 肝胰腺用抗LvAST熒光抗體染色, b: 肝胰腺經(jīng)熒光標(biāo)記的陰性血清染色的陰性對照, c: 肌肉用抗LvAST熒光抗體染色, d: 肌肉經(jīng)熒光標(biāo)記的陰性血清染色的陰性對照, e: 鰓用抗LvAST熒光抗體染色, f: 鰓經(jīng)熒光標(biāo)記的陰性血清染色的陰性對照, g: 淋巴器官用抗LvAST熒光抗體染色, h: 淋巴器官經(jīng)熒光標(biāo)記的陰性血清染色的陰性對照

圖4 凡納濱對蝦組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞的熒光免疫化學(xué)檢測的熒光強(qiáng)度定量分析

A. 石蠟切片的熒光免疫化學(xué)檢測; B. 培養(yǎng)的血淋巴細(xì)胞經(jīng)乙醇處理前后熒光免疫化學(xué)檢測

通過熒光定量PCR檢測, 本文揭示的mRNA主要在肝胰腺、肌肉和鰓中表達(dá), 在淋巴器官和血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量很低, 這與Hsiao等(2010)的結(jié)果有所差異, 他認(rèn)為造血激素主要分布在血淋巴細(xì)胞上, 而在肝胰腺中分布較少, 這種差異是否是與實(shí)驗(yàn)所用的蝦的狀態(tài)、種類等因素有關(guān), 還需要進(jìn)一步證明。

本實(shí)驗(yàn)首次通過免疫熒光細(xì)胞染色和免疫熒光組織化學(xué)染色的方法對LvAST在血淋巴細(xì)胞和肝胰腺上進(jìn)行了LvAST蛋白的定位, 發(fā)現(xiàn)LvAST不僅在所有血淋巴細(xì)胞內(nèi)存在, 而且也能分布在部分血淋巴細(xì)胞的表面, 并且根據(jù)劉勇等熒光強(qiáng)度的相對定量的計(jì)算方法, 在血淋巴細(xì)胞膜上的LvAST約為血淋巴細(xì)胞內(nèi)及表明總量的50%; 而其組織分布特征顯示LvAST在凡納濱對蝦的肝胰腺、鰓、肌肉和淋巴器官中均存在, 在肝胰腺中分布最多, 其蛋白的分布特征與mRNA的表達(dá)特征基本相符, 但由于前者為蛋白水平后者為mRNA水平, 存在蛋白翻譯水平的調(diào)控, 因此存在少許差異。LvAST在血淋巴細(xì)胞表面分布呈現(xiàn)的細(xì)胞差異可能具有重要的血細(xì)胞分類意義。目前對這一方面還沒有相關(guān)報(bào)道, 我們將在接下來的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明。

在LvAST的免疫熒光細(xì)胞定位觀察時(shí), 為了更準(zhǔn)確地證實(shí)LvAST是否在細(xì)胞膜上定位, 排除可能因?yàn)榧?xì)胞不完整而帶來的干擾, 作者使用了綠色熒光標(biāo)記的抗β-actin抗體作為細(xì)胞膜通透性的證明, 使實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)刈C明了LvAST的確在血淋巴細(xì)胞膜的外表面存在分布。本實(shí)驗(yàn)采用DyLight染料標(biāo)記抗體, 此染料的熒光強(qiáng)度較高, 光穩(wěn)定性較好并且在很寬的pH范圍內(nèi)都有很好的熒光信號, 并且此染料的水溶性保證偶聯(lián)反應(yīng)中較高的染料-蛋白比例而不會引起染料的沉淀, 同時(shí)此染料的非滲透性保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確。

本文通過熒光免疫技術(shù), 成功實(shí)現(xiàn)了LvAST在細(xì)胞和組織中的定位觀察, 首次證實(shí)LvAST幾乎在所有血淋巴細(xì)胞內(nèi)及部分細(xì)胞膜外均有分布, 這一研究為下一步明確LvAST、ATP合酶和WSSV-VP37之間在細(xì)胞水平的相互作用研究提供了技術(shù)途徑。

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THE TISSUE DISTRIBUTION AND CELLULAR LOCALIZATION OF ASTAKINE IN SHRIMP

XU Meng-Lin1, 2, LIANG Yan2, LU Jin-Feng2, WANG Xiao-Wen1, 2, LI Chen2,XING Jing1, HUANG Jie2

(1. The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, College of Fisherie, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, China)

Astakine, a cytokine in crustaceans, involves in hematopoiesis for stimulating cell proliferation and differentiation, and plays a key role in crustacean immune responses. In our previous studies, the gene ofin shrimp(LvAST) was cloned and expressed. To get more information about the function of LvAST, its tissue distribution was quantified by real time RCR; and additionally, its cellular localization was observed by immunofluorescence method. Results reveald that thegene distributes widely in different tissues, with relative higher expression in hepatopancreas, muscle, and gills. The cellular location recognized by Dylight 649 labeled polyclonal antibody of LvAST showed that LvAST is expressed not only in hemocytes but also on some hemocytes. In histology immunofluorescence method, we observed that the LvAST protein distributed in hepatopancreas, gills, muscle, and lymphoid organ, which is in accordance with the result of its gene expression in shrimp tissues.

; astakine; immunofluorescence; location; laser-scanning confocal microscope

10.11693/hyhz20121206001

* 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目課題, 2012CB114400號; 國家自然科學(xué)基金課題, 31101934號; 基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi), 20603022013009號; 中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助, 2010-cb-06號。徐萌霖, 碩士研究生, E-mail: weihaichongzi@163.com

黃倢, 研究員, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

2012-12-06,

2013-02-12

Q346