紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)性別差異微衛(wèi)星標記的篩選*

岳 亮 馬愛軍 趙艷飛 王新安 何偉國 孟雪松 翟介明 劉圣聰

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紅鰭東方鲀()性別差異微衛(wèi)星標記的篩選*

岳 亮1, 2馬愛軍1①趙艷飛1王新安1何偉國1孟雪松3翟介明4劉圣聰3

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室 青島 266071; 2. 上海海洋大學 上海 201306; 3. 大連天正實業(yè)有限公司 大連 116000; 4. 萊州明波水產有限公司 煙臺 261418)

采用以BSA為基礎的微衛(wèi)星標記技術對紅鰭東方鲀()雌、雄群體進行性別差異標記篩選的研究。用雌、雄各30個個體構建雌、雄基因池, 利用66對微衛(wèi)星引物掃描雌、雄基因池。在雌、雄基因池中擴增出差異條帶的引物有8對。用兩個各包括30個雌、雄個體的群體對這8對引物進行兩輪個體驗證。結果表明, 引物f383在兩個雌、雄群體中擴增出的差異條帶與性別都呈極顯著相關性(分別為0.710和0.673)(<0.01), f383是與紅鰭東方鲀雄性呈正相關的微衛(wèi)星標記。紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標記的獲得, 為其性別相關基因的克隆和性別決定機制的研究提供理論基礎。

紅鰭東方鲀; 微衛(wèi)星; 性別差異

魚類在脊椎動物的系統進化中處于承前啟后的關鍵地位, 與魚類性別有關的研究是國際上的科研熱點。魚類進化歷史長久, 演化分支繁多(尚曉莉等, 2010), 作為低等脊椎動物, 其性別決定和分化機制相當復雜, 魚類的性別決定機制具有原始性、多樣性和易變性, 并具有所有脊椎動物的性別決定方式(文愛韻等, 2008)。魚類性別發(fā)育是以遺傳基因為基礎, 并受到自身內分泌調節(jié)和外界環(huán)境的影響, 是三者相互作用的結果(高建軍等, 2010), 這在一定程度上給魚類性別相關的研究增加難度。魚類性別相關的研究既具有重要的理論價值, 又具有可觀的實用價值, 一直吸引著國內外魚類研究者的極大關注。分子生物學技術的快速發(fā)展為研究者們指明了方向。DNA分子標記具有標記位點多、標記穩(wěn)定可靠、特異性強、實驗重復性強等特點(劉云國等, 2009), 為辨別魚類的性別開辟了出路。RFLP、RAPD、AFLP 和SSR等是常用的分子標記技術。微衛(wèi)星DNA以其保守性好、易于檢測、多態(tài)性高、共顯性遺傳、在基因組中均勻分布等特點被廣泛應用于遺傳圖譜的構建、品系間的遺傳結構特點及性狀與位點的連鎖分析等方面的研究(徐興莉等, 2011)。微衛(wèi)星標記技術也被用于尋找與魚類性別相關的分子標記。在虹鱒微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜的研究中, Sakamoto等(2000)在雄性圖譜中發(fā)現兩個與性別決定位點連鎖的微衛(wèi)星標記OmyFGT19- TUF和OmyRGT28TUF。隨后, 另外兩個與虹鱒雄性性別決定位點連鎖的微衛(wèi)星標記Ots517NWFSC和Ssa1NVH被Woram等(2003)發(fā)現。Stein等(2002)從紅點鮭的Y染色體分離出與性別連鎖的微衛(wèi)星位點Yp136。Waldbieser等(2001)在構建溝鯰()遺傳連鎖圖譜的過程中, 發(fā)現7個與性別決定位點緊密連鎖的微衛(wèi)星位點。Lee等(2004)在奧利亞羅非魚中發(fā)現11個與表型性別連鎖的微衛(wèi)星標記。目前, 國內有關應用微衛(wèi)星DNA標記技術已經篩選出的魚類性別差異標記的報道罕見。

紅鰭東方鲀(), 隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(), 是暖水性海洋底棲魚類, 味道鮮美、規(guī)格較大、肉質比較緊、營養(yǎng)豐富、經濟價值高, 為我國北方地區(qū)的優(yōu)良海水養(yǎng)殖魚類之一。由于紅鰭東方鲀的卵巢有劇毒, 而精巢無毒, 口感嫩滑, 受到美食者青睞, 因而, 雄性紅鰭東方鲀的市場價值更高。因此, 開展紅鰭東方鲀性別差異分子標記篩選的研究, 在早期生長階段篩選出雄性魚種養(yǎng)殖, 對提高紅鰭東方鲀的經濟效益和市場價值有重要的現實意義, 也為其性別決定機制和性別相關基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的兩批紅鰭東方鲀樣品, 第一批來自煙臺市萊州明波水產有限公司, 雌、雄各30尾, 體長為33—39cm, 體重為1.18—1.95kg; 第二批來自大連天正實業(yè)有限公司, 雌、雄各30尾, 體長為36—43cm, 體重為1.52—2.98kg。解剖后觀察性腺, 辨別出雌、雄, 每尾魚取少量尾鰭于離心管中, 編號后至于-20°C冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取和BSA基因池的建立 從-20°C冰箱中取出保存的樣品, 快速剪取30mg尾鰭, 用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA樣品用核酸測序儀測定濃度和260/280值。每個DNA樣品取出部分稀釋到50ng/mL, 其余DNA原液放在-20°C冰箱保存。

雌、雄個體各30個, 從稀釋到50ng/mL的DNA溶液中各取10mL混合成相應的雌、雄基因池,-20°C保存基因池樣品。

1.2.2 引物合成及PCR擴增 從Kai等(2011)與紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜有關的文章中挑選66對雌、雄圖譜中特異的微衛(wèi)星引物。PCR反應體系為: 10×Taq buffer 1.6mL, dNTPs 1.3mL (2.5mmoL/L), DNA 1.2mL (50ng/mL),酶 0.2mL (5U/mL), 上下游引物各0.7mL (10mmoL/L), 加無菌雙蒸水補至20mL。PCR反應程序: 94°C預變性5min; 94°C變性30s, 退火30s, 退火溫度依引物而異, 72°C復性30s, 30個循環(huán); 72°C延伸10min, 4°C保存。取PCR擴增產物5mL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 記錄具有穩(wěn)定擴增產物的引物。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR擴增產物經94°C變性5min, 冰浴10min, 用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳條件: 電壓490V, 電流60mA, 功率28W。先預電泳30min, 上樣后電泳2h左右。

1.2.4 差異條帶的篩選 記錄并分析聚丙烯酰胺電泳條帶, 通過雌、雄基因池的電泳結果, 初步篩選在兩基因池間能擴增出差異等位基因片段的微衛(wèi)星位點。用相應的引物, 按照上述的PCR反應條件對雌、雄各30個紅鰭東方鲀個體進行PCR擴增。分析有差異的引物在個體上的具體擴增情況。如果差異等位基因片段在雌、雄群體中出現次數差異極顯著, 則作為候選的性別特異微衛(wèi)星標記, 其對應的引物作為下一輪驗證的候選引物。

以第二批紅鰭東方鲀雌、雄各30個個體基因組DNA為模板, 用候選的引物按照相同的條件進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 驗證候選標記的準確性。

1.2.5 差異等位基因片段的回收 利用無外源DNA污染的手術刀從8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上切目的條帶, 放入盛有 20mL去離子水的 1.5mL離心管中, 用剪刀剪碎, 置于 4°C過夜, 使膠中的DNA盡可能地溶解到液體中(劉昕, 2011)。然后, 12000r/min離心約 2min, 仔細吸取上清作為再次PCR擴增的模板, 按照上述PCR體系和程序進行反應。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIAN gel Midi Purification Kit)回收目的條帶。按照pGM-T克隆試劑盒的說明, 將目的DNA片段克隆到pGM-T載體上, 將陽性克隆送到上海生工生物工程公司測序。利用Chromas軟件對測序結果剪切和拼接(只留下紅鰭東方鲀本身的基因組序列), 用DNASTAR軟件中的SeqMan對同一標記的多個序列進行比對來確定DNA序列, 通過數據庫BLAST比對, 搜索該序列的同源序列。

2 結果

2.1 基因組DNA的提取

通過試劑盒提取的紅鰭東方鲀雌、雄群體基因組DNA, 經過分光光度計檢測,260/280值在1.8—2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳圖片顯示DNA片段較完整, 沒有大量蛋白和RNA存在, 說明DNA質量較高。圖1為部分DNA電泳圖。

圖1 樣品DNA電泳圖

表1 8對微衛(wèi)星標記引物序列

2.2 BSA分池及PCR擴增結果分析

用66對引物對所構建的雌、雄基因池進行PCR擴增, 用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR產物電泳檢測, 檢測結果顯示: 在雌、雄基因池中擴增出差異條帶的引物有8對, 分別為f172、f383、f638、f1497、f1050、f1372、f1637、f152。引物序列見表1。電泳結果如圖2所示。

2.3 差異等位基因片段在個體中的驗證

將BSA池中篩選到的8對引物在構建基因池的雌、雄各30個個體中進行PCR擴增, 通過8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 分析差異等位基因片段在不同雌、雄個體的擴增情況。結果發(fā)現: 引物f1050在30個雌性個體中均未擴增出條帶, 在30個雄性個體中有8個個體擴增出條帶; 引物f383在幾乎所有(28/30)雄性個體中擴增出條帶, 在個別(7/30)雌性個體中出現條帶。這與BSA擴增結果一致。結果見圖3。

圖2 引物f172、f383、f638、f1497、f1050、f1372、f1637、f152在BSA中的擴增條帶

a. 引物f172、f383、f638、f1497在BSA中的擴增條帶; b. 引物f1050、f1372、f1637、f152在BSA中的擴增條帶。M1. 100bp DNA標記; M2. 50bp DNA標記

用第二批紅鰭東方鲀群體雌、雄各30個個體對f1050和f383這兩對引物進行第二輪的個體驗證顯示: 引物f1050在雌、雄群體間的擴增條帶數無顯著差異, 而引物f383在雌性群體中只有極個別(3/30)個體中擴增出條帶, 在雄性群體30個體中有23個個體擴增出條帶。具體結果如圖4所示。

結合圖3和圖4分析, 引物f383經過2個紅鰭東方鲀群體共120個個體的驗證, 在雌、雄個體中擴增出的條帶都出現差異極顯著的結果, 差異等位基因片段在60個雌性個體中出現10次, 頻率很低, 為16.7%; 而在雄性60個個體中出現51次, 頻率極高, 為85.0%。由此可知, 引物f383該位點的差異片段對紅鰭東方鲀的性別極具雄性偏好性, 該位點應該與紅鰭東方鲀性別決定區(qū)域存在相關關系。引物f383是紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜中第19號染色體上的引物, 實驗結果與Kai等(2011)的研究結果相符合。

圖3 引物f383(a)和f1050(b)在雌、雄群體中擴增的顯著差異條帶

2.4 差異等位基因片段的克隆與測序結果

對與紅鰭東方鲀雄性呈極顯著正相關的微衛(wèi)星位點f383的差異等位基因片段克隆并進行測序。利用Chromas 軟件對測序結果剪切和拼接(只留下紅鰭東方鲀本身的基因組序列)序列如圖5所示。

利用Blast比對, 搜索這條序列的同源序列, 結果表明這條序列為公布的紅鰭東方鲀第19號染色體上的一段, 同源性高達98%, 序列的覆蓋率達100%。

3 討論

高等脊椎動物的性別決定機制皆為人知, 而魚類作為低等脊椎動物, 性別分化處于原始階段, 性別決定和分化機制相當復雜, 魚類的表型性別既受基因的決定, 又受環(huán)境因子的影響(李靜等, 2007)。在被研究報道過的魚類中, 有性染色體的魚類占10% (Devlin, 2002)。在有性染色體的魚類中, 決定性別的基因并不明顯地集中于性染色體上, 常染色體上的基因更多地參與到性別決定中(姚延丹, 2009), 羅非魚性別決定機制的研究為此提供佐證, Hammerman和Avtalion(1979)提出性別決定的“常染色體平衡理論”。因此, 根據染色體的形態(tài)來區(qū)分魚類的性別在大多數魚類中行不通?；贒NA水平的遺傳性別鑒定方法可以克服這一困難, 但首先需要篩選性別特異的DNA標記, DNA標記是研究魚類性連鎖的重要工具, 因為DNA的分子結構不會受生理或環(huán)境因素的變化而改變(馬洪雨, 2009)。

紅鰭東方鲀味道鮮美、營養(yǎng)豐富、脂肪含量低、經濟價值高, 是一種具有較大市場發(fā)展?jié)摿Φ拿麅?yōu)海水養(yǎng)殖魚類。但是, 由于卵巢有劇毒, 誤食甚至喪命; 而精巢無毒, 豐腴鮮美、潔白如乳、入口即化、美妙絕倫, 因此價格不菲(陸麗君, 2012)。因此, 開展紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標記篩選的研究, 在其生長早期階段通過分子標記技術選擇雄性魚養(yǎng)殖, 可以減少成魚養(yǎng)殖的工作量, 提高資源的利用率, 增加經濟效益。

本研究采用分離群體分組分析法(BSA法), 用66對微衛(wèi)星引物對雌、雄基因池掃描, 初步篩選出在雌、雄基因池間擴增出差異條帶的8對引物。如果與用單個個體進行引物篩選的方法相比, BSA法工作量大大減少, 為前者的1/30。最終篩選出的引物f383在雌、雄群體間擴增出的條帶均達到差異極顯著的水平。皮爾遜相關性檢測結果表明, 兩個群體中“雌雄分組”和“條帶的有無”均呈現極顯著的相關性(0.710和0.673)(<0.01), 表明引物f383與紅鰭東方鲀的性別相關, 是與雄性正相關的標記。采用與劉改艷(2011)相同的統計方法, 在兩個群體中, 該標記在60個雄性個體中出現51個條帶, 雄性正確鑒定率為85.0%; 60個雌性個體中50個無帶, 雌性正確鑒定率為83.3%; 性別的平均正確鑒定率為84.17%, 在個體中的出現率為50.83%。

圖4 引物f383在雌、雄群體中擴增的顯著差異條帶

a. 引物f383在編號1—15的雌、雄群體中擴增的顯著差異條帶; b. 引物f383在編號16—30的雌、雄群體中擴增的顯著差異條帶

圖5 紅鰭東方鲀雄性相關微衛(wèi)星標記DNA序列

與紅鰭東方鲀雄性呈正相關的微衛(wèi)星標記在雌性個體中出現的頻率是16.7%, 在雄性個體中出現的頻率是85.0%。說明該微衛(wèi)星標記不是紅鰭東方鲀雄性特異的分子標記, 而是與雄性緊密連鎖的標記, 得到此結論可能有如下原因: (1) 實驗所用材料不是來自同一家系, 環(huán)境條件不相同, 可能對紅鰭東方鲀的表型性別有影響, 導致少數個體的基因型和表型相悖; (2) 紅鰭東方鲀不存在性染色體或性染色體的分化程度較低。舒琥等(2010)在鲀形目染色體組型分析的研究中未發(fā)現紅鰭東方鲀具有異型性染色體, 為該推測提供了理論基礎; (3) 在減數分裂過程中發(fā)生染色體交換重組(楊東, 2006)。

Kai等(2011)發(fā)現, 以目前紅鰭東方鲀完整的Tru19(總長度為16Mb)圖譜為基礎, 性別決定基因可能位于跨度為5Mb的區(qū)域, 該區(qū)域位于大的常染色體一樣的區(qū)域側翼。這對本實驗引物的選擇有重要的指示性作用, 在此基礎上選擇第19號染色體上的所有引物進行實驗。Kikuchi等(2007)通過基因組范圍的關聯分析表明, 第19號連鎖群的單一染色體區(qū)域決定紅鰭東方鲀的性別, 而本實驗篩選的性別差異引物f383來自Kai等(2011)構建的紅鰭東方鲀遺傳連鎖圖譜第19號染色體, 這與Kikuchi等(2007)的研究結果相符合。

紅鰭東方鲀性別差異微衛(wèi)星標記的獲得, 為其性別相關基因的克隆和性別決定機制的研究提供理論基礎。以該標記為基礎的紅鰭東方鲀性別鑒定技術可以在早期生長階段對紅鰭東方鲀進行性別選擇, 實現分子標記輔助育種, 這對生產實踐具有重要的指導作用和現實意義, 為紅鰭東方鲀產業(yè)的發(fā)展提供更大的發(fā)展空間。

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SCREENING OF MICROSATELLITES GENDER-INDICATIVE MARKERS OF

YUE Liang1, 2, MA Ai-Jun1, ZHAO Yan-Fei1, WANG Xin-An1, HE Wei-Guo1,MENG Xue-Song3, ZHAI Jie-Ming4, LIU Sheng-Cong3

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 2. Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Dalian Tianzheng Industrial Co. Ltd., Dalian 116000, China; 4. Laizhou Mingbo Aquatic Products Co. Ltd., Yantai 261418, China)

To determine the gender differences of male and female populations of, we screened the microsatellites based on bulked segregation analysis (BSA). Two gene pools were constructed with 60 individuals each containing 30 males and females, and scanned by 66 pairs of microsatellite primers, from which eight pairs of microsatellite primers of different bands were amplified and verified for the first round in the 60 individuals. The results show that the bands amplified by primers f1050 and f383 in male and female individuals differed significantly. And in the second round verification, bands amplified by primers f1050 in male and female individuals did not differ significantly, while bands amplified by primers f383 in male and female individuals differed significantly. In other words, primer f383 occurred in male individuals in two rounds of verification in coefficient 0.710 and 0.673, respectively, it is paternity-indicative for. The discovery shall provide a theoretical basis for gender-related gene cloning and sex determination.

; microsatellite; gender differences

10.11693/hyhz20120629001

* 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(20603022012005)資助。岳亮, 碩士研究生, E-mail: liang7650960@163.com

馬愛軍, 博士, 研究員, 博士生導師, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

2012-06-29,

2012-10-23

Q953