三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) CYP4C基因的cDNA克隆及表達(dá)分析*

張曉燕 李 健 劉 萍 陳 萍 孫 銘, 3 楊愛國

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三疣梭子蟹() CYP4C基因的cDNA克隆及表達(dá)分析*

張曉燕1, 2李 健1①劉 萍1陳 萍1孫 銘1, 3楊愛國4

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 3. 中國海洋大學(xué) 青島 266071; 4. 青島匯泉海洋科技開發(fā)有限公司 青島 266071)

采用RT-PCR及Smart-TMRace技術(shù), 首次獲得三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全長序列。該基因全長1888bp, 編碼一個(gè)由514個(gè)氨基酸組成的多肽, 預(yù)測分子量大小為59.54kDa, 理論等電點(diǎn)為8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血紅素結(jié)合區(qū)(FxxGxxxCxG)。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 三疣梭子蟹CYP4C基因與岸蟹、凡納濱對(duì)蝦、日本沼蝦、中國對(duì)蝦、溝蝦、紅螯螯蝦的同源性分別為88%、72%、66%、59%、60%、59%。熒光定量RT-PCR結(jié)果表明, CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鰓和心臟中均有分布, 在肝胰腺中表達(dá)量最高。高鹽(45)脅迫后, 三疣梭子蟹CYP4C的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組, 隨著脅迫時(shí)間的延長出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì), 在脅迫48h后表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組水平; 低鹽(11)脅迫條件下, CYP4C的表達(dá)水平隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì), 且從脅迫6h開始顯著低于對(duì)照組。研究推測, CYP4C基因參與三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié), 是蛻皮機(jī)制的調(diào)控因子之一。

三疣梭子蟹(), CYP4C, 基因克隆, 表達(dá), 鹽度脅迫

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)酶系是一個(gè)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等各種生物有機(jī)體中的超基因家族, 它參與多種外源物質(zhì)(藥物、有機(jī)污染物等)和內(nèi)源物質(zhì)(蛻皮激素、脂肪酸、保幼激素等)在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化與代謝過程(Simpson, 1997; 冷欣夫等, 2001), 是細(xì)胞色素P450家族中最古老的家族之一。在脊椎動(dòng)物中, 主要參與脂肪酸及前列腺素的ω-羥基化, 參與膽汁酸的生物合成(Lundell, 2002); CYP4在昆蟲中的研究較為深入, 可以被許多外源物質(zhì)(煙堿、殺蟲劑、外毒素等)誘導(dǎo), 參與昆蟲的解毒機(jī)制及蛻皮激素、保幼激素等內(nèi)源物的合成、代謝(Feyereisen, 1999; 騰達(dá)等, 2004; 李秀蘭等, 2005; 王燕紅等, 2009)。在海洋無脊椎動(dòng)物中, CYP4的研究相對(duì)較少, 甲殼動(dòng)物中僅有岸蟹()、美洲螯蝦()、溝蝦()和凡納濱對(duì)蝦()等少數(shù)物種的CYP4基因得到克隆(Snyder, 1998; Aragon, 2002; Rewitz, 2003; 夏西超等, 2012), 主要涉及多環(huán)芳烴類、海洋污染物等外源物質(zhì)對(duì)其的誘導(dǎo)作用及其代謝, 以及參與蛻皮激素等內(nèi)源物質(zhì)的合成代謝等功能的研究, 而有關(guān)三疣梭子蟹()這方面的研究尚未見報(bào)道。

三疣梭子蟹(), 屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portinidae), 梭子蟹屬(), 廣泛分布于中國近海、日本、朝鮮半島及馬來西亞群島等海域(薛俊增等, 1997), 是我國大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類, 生長快、肉味鮮美, 營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高, 現(xiàn)已成為我國重要的人工養(yǎng)殖和海洋捕撈種類之一。

鹽度是影響水生動(dòng)物生理狀態(tài)的主要環(huán)境因子之一, 鹽度的變化對(duì)蝦蟹類蛻皮、生長代謝及免疫都有顯著的影響(Mu, 2005; Romano, 2006; 楊其彬等, 2008; 王沖等, 2010)。CYP4作為生長、蛻皮和調(diào)控代謝相關(guān)基因, 環(huán)境因子的急劇變化對(duì)其產(chǎn)生影響方面的研究, 目前尚未見報(bào)道。本研究通過克隆獲得三疣梭子蟹細(xì)胞色素CYP4C基因全長序列, 并對(duì)其在急性鹽度脅迫下組織表達(dá)特征進(jìn)行了初步研究, 以期為三疣梭子蟹CYP4C與環(huán)境鹽度適應(yīng)的相關(guān)性研究及其在鹽度適應(yīng)過程中生理功能的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選擇三疣梭子蟹體重在100—120g的健康個(gè)體, 于山東昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司室內(nèi)水泥養(yǎng)殖池進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)試劑 SMARTTMRACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit購自Clontech公司; TaKaRa LA Taq 、M-MLV、Oligo(dT)18、DNaseⅠ、PMD18-T和Top10感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司; Trizol Reagent 購自Invitrogen公司; 實(shí)驗(yàn)所用引物為上海生物工程有限公司合成, 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取健康三疣梭子蟹的肝胰腺于液氮中研磨, Trizol試劑提取總RNA, 核酸蛋白測定儀(Biodropsis, BO-1000)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量及完整性, DNaseⅠ去除基因組DNA后, 用M-MLV Promega產(chǎn)品完成第一鏈cDNA合成, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA片段的克隆

從NCBI中搜尋溝蝦()、紅螯螯蝦()、岸蟹()和凡納濱對(duì)蝦()的CYP4C cDNA序列, 利用ClustalX對(duì)以上序列進(jìn)行同源性對(duì)比以確定其保守區(qū)域, 設(shè)計(jì)兼并引物F和R。以三疣梭子蟹肝胰腺cDNA為模板, 以F和R為引物, 進(jìn)行三疣梭子蟹CYP4C基因中間片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50μL, 反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min; 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1min, 30個(gè)循環(huán); 最后72°C延伸10min, 4°C保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所擴(kuò)增的片段大小。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化, 與pMD18-T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞, 陽性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后, 送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 CYP4C基因全長的克隆

測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)(http://www.ncbi.nlm. nih.gov)后, 其實(shí)驗(yàn)所得三疣梭子蟹CYP4基因部分序列與其他物種的CYP4基因同源。以已獲得的CYP4C基因片段設(shè)計(jì)3′和5′RACE特異性引物race3′和race5′(表1)。利用SMARTTMRACE Amplification Kit擴(kuò)增得到cDNA全長。

表1 本研究所用引物序列

Tab.1 The sequence of primers used in this study

1.5 序列分析

使用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN和BLASTX軟件對(duì)CYP4基因的同源性進(jìn)行分析, 在http://www.expasy.ch/tools/pi上進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。利用PredictProtein服務(wù)器對(duì)CYP4C蛋白序列進(jìn)行功能位點(diǎn)分析(PROSITE motif search), 利用SignalP3.0(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)_tool.html)工具進(jìn)行蛋白信號(hào)肽分析, 采用Vector NTI Advance10.3軟件和ClustalW軟件將克隆的序列和已知的其他物種的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析, 用MEGA 4.1軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 半致死鹽度預(yù)實(shí)驗(yàn)

三疣梭子蟹的適應(yīng)鹽度為13—38, 最適生活鹽度為20—35(季東升, 2005)。選取11、17、23、30、37、45六個(gè)鹽度進(jìn)行半致死鹽度預(yù)實(shí)驗(yàn), 在7天的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 鹽度30的實(shí)驗(yàn)組死亡率為零, 在72h和96h的半致死鹽度分別為45和11。因此, 本實(shí)驗(yàn)選擇11和45為極限鹽度組, 30為正常對(duì)照組。

1.7 急性鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)

選擇11、30和45三個(gè)鹽度分別作為低鹽、對(duì)照和高鹽3個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組, 每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行, 各實(shí)驗(yàn)組鹽度由天然海水加海水晶或24h曝氣自來水配置而成。三疣梭子蟹由室外養(yǎng)殖池塘轉(zhuǎn)移到鹽度為30的海水中暫養(yǎng)7天開始試驗(yàn)。每個(gè)處理每個(gè)平行分別挑選30只健康個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 分別于脅迫后0、3、12、24、48、72h取肝胰腺組織, 液氮保存, 用于RNA的提取, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只。另取3只健康三疣梭子蟹的肝胰腺、鰓、肌肉、心臟和眼柄組織, 液氮保存, 用于測定CYP4C基因在不同組織中的表達(dá) 分析。

1.8 CYP4C基因mRNA Real-time PCR定量檢測

取三疣梭子蟹各個(gè)組織和經(jīng)鹽度脅迫后的不同時(shí)間點(diǎn)的肝胰腺組織的cDNA, 用DEPC水稀釋10倍作為模板, 進(jìn)行CYP4C基因的表達(dá)量檢測。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為25μL, 包括: SYBR Premix Ex TaqTM II(2×) 12.5μL, ROX Reference Dye II 0.5μL, cDNA模板2μL, PCR正反引物(10μmol/L)各1μL, DEPC水8μL。以三疣梭子蟹18S rRNA為內(nèi)參基因(表1), 以F1和R1為引物(表1), 進(jìn)行CYP4C基因熒光定量分析。PCR反應(yīng)條件: 95°C 30 s; 95°C 5 s, 60°C 34 s, 40個(gè)循環(huán), 每個(gè)樣品采取三個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR熒光定量PCR儀, 采用2-DDCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 用SPSS 11.0軟件進(jìn)行顯著性分析(<0.05)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE), 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 并進(jìn)行Duncan 氏多重比較(<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 CYP4C基因全長cDNA序列分析

采用RACE方法擴(kuò)增獲得三疣梭子蟹CYP4C基因全長cDNA序列, GenBank登錄號(hào): JN835470。CYP4C基因全長1888bp, 其中, 開放閱讀框(ORF)為1545bp, 5′和3′的非編碼區(qū)分別為122bp和223bp, 編碼一個(gè)由514個(gè)氨基酸組成的多肽, 預(yù)測分子量大小為59.54kDa, 理論等電點(diǎn)為8.08。3′端含有一個(gè)終止密碼子(TGA), 并含有多腺苷酸信號(hào)ATTAAA和poly(A)尾。

利用Predictprotein對(duì)三疣梭子蟹CYP4C蛋白序列進(jìn)行功能位點(diǎn)分析(PROSITE motif search), 發(fā)現(xiàn)該蛋白序列具有多個(gè)功能位點(diǎn), 包括3個(gè)N端糖基化位點(diǎn)(296-299, 329-332和482-485); 5個(gè)酪蛋白磷酸化位點(diǎn): (206-209, 258-261, 305-308, 361-364, 484-487); 3個(gè)肉蔻?；稽c(diǎn): (125-130, 197-202, 459-464); 8個(gè)蛋白激酶K磷酸化位點(diǎn): (105-107, 130-132, 136-138, 161-163, 356-358, 413-415, 483-485, 511-513); 2個(gè)酰胺化位點(diǎn): (130-133, 282-285); 1個(gè)P450家族特有的亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)(450-459)。

圖1 三疣梭子蟹CYP4C基因的核甘酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

方框內(nèi)的ATG為起始密碼子, 終止密碼子由*表示, 雙劃線為CYP4家族特征序列, 位于保守的I螺旋區(qū); 方框內(nèi)是K螺旋保守區(qū), 黑粗線為血紅素結(jié)合區(qū)保守序列(FxxGxxxCxG)

2.2 CYP4C基因多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用Clustal W1.8軟件對(duì)三疣梭子蟹CYP4C氨基酸序列進(jìn)行同源序列分析, 結(jié)果如圖3所示。三疣梭子蟹CYP4C基因與岸蟹()、凡納濱對(duì)蝦()、日本沼蝦()、中國對(duì)蝦()、溝蝦()、紅螯螯蝦()的同源性分別為88%、72%、66%、59%、60%、59%。利用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 結(jié)果表明, 三疣梭子蟹CYP4C基因與甲殼動(dòng)物中的青蟹緊密聚為一支, 之后又與凡納濱對(duì)蝦和日本沼蝦聚為一支(圖2)。

2.3 CYP4C基因在三疣梭子蟹各組織中的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明: CYP4C基因在心臟、肌肉、肝胰腺、眼柄和鰓中都有表達(dá)。其中, 在肝胰腺中表達(dá)量最高, 其次是鰓, 在心臟中表達(dá)最少(圖4)。

Real-time PCR檢測三疣梭子蟹肝胰腺在鹽度脅迫(高鹽、低鹽)下的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CYP4C基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 高鹽脅迫后, 三疣梭子蟹CYP4C的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組, 隨著脅迫時(shí)間的延長出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì), 在脅迫48h后表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組水平; 低鹽脅迫條件下, CYP4C的表達(dá)水平隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì), 且從脅迫6h開始顯著低于對(duì)照組(<0.05)。

3 討論

本研究首次克隆了三疣梭子蟹CYP4C基因全長cDNA序列, 全長1888bp, 編碼一個(gè)由514個(gè)氨基酸組成的多肽。通過與已知的P450家族的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 該基因的氨基酸序列中含有典型的P450蛋白保守序列。這些區(qū)域包括: P450最具有特征的血紅素結(jié)合區(qū)(FxxGxxxCxG)和絕對(duì)保守的半胱氨酸(Cys); 位于螺旋K中的絕對(duì)保守序列(ExxR), 以及疏水螺旋I區(qū)的中心部分(GxxT)。其蛋白序列還包含糖基化、磷酸化、酞基化等多個(gè)功能位點(diǎn), 有助于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的主要定位、穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)以及功能作用的發(fā)現(xiàn)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), 三疣梭子蟹CYP4C基因與甲殼動(dòng)物的青蟹、凡納濱對(duì)蝦和日本沼蝦的親緣關(guān)系最近。

圖2 不同物種的CYP4C基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 三疣梭子蟹CYP4C氨基酸序列與其他甲殼動(dòng)物CYP4的氨基酸序列比對(duì)

相同的氨基酸用暗色背景表示; 缺失的氨基酸用“.”表示; 所使用CYP4基因的GenBank登錄號(hào)見圖2

圖4 三疣梭子蟹CYP4C基因在器官/組織中表達(dá)量

細(xì)胞色素P450是一種廣泛存在于生物界的多功能酶系, 不僅具有顯著的種屬差異性, 還表現(xiàn)出組織、器官的差異性。如在脊椎動(dòng)物中, P450在肝臟中的含量最豐富, 其他組織如皮膚、肺、腎、胃、腦、消化道、胃腸道、淋巴細(xì)胞、單核粒細(xì)胞和骨髓等組織中也有發(fā)現(xiàn)(Arukwe, 2002; Ortiz-Delgado, 2002; 任彭等, 2006); 在昆蟲中, 中腸、脂肪體以及馬氏管的P450含量比較豐富(邱立紅等, 1999; 邱星輝等, 2000); 在魚類中, 在肝、腸、腎、鰓等組織中表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平(朱磊等, 2011)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明, 三疣梭子蟹CYP4C基因在肝胰腺、鰓、肌肉、眼柄和心臟中都有表達(dá), 在肝胰腺中表達(dá)量最高, 說明肝胰腺是CYP4C基因的主要合成場所, 在凡納濱對(duì)蝦的研究中也有類似結(jié)果(夏西超等, 2012)。許多學(xué)者認(rèn)為, CYP450在組織器官中的分布具有選擇性, 如肝臟作為藥物代謝的主要場所, CYP450的含量也是最豐富的。鰓、皮膚等組織作為外源物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)的第一道防線, 其含量也是比較高的。CYP450的這種選擇性分布, 可以在生物體最大限度的發(fā)揮作用(Hodgson, 1985; 邱星輝等, 1997)。

圖5 三疣梭子蟹CYP4C基因在鹽度脅迫條件下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量

鹽度變化能夠引起甲殼動(dòng)物自身的滲透調(diào)節(jié), 適當(dāng)?shù)亟档望}度能夠縮短甲殼動(dòng)物的蛻皮周期、提高蛻皮率達(dá)到促進(jìn)生長的作用(Bray, 1994; Mu, 2005; 李英等, 2010)。有節(jié)律地降低鹽度可以提高中國對(duì)蝦()的蛻皮率, 加快其生長(Mu, 2005)。青蟹在鹽度15時(shí)退殼率明顯高于鹽度25實(shí)驗(yàn)組(于忠利等, 2010), 羅氏沼蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等廣鹽性物種也有低鹽環(huán)境加快蛻皮的現(xiàn)象(徐桂榮等, 1997; 楊其彬等, 2008)。甲殼動(dòng)物的蛻皮活動(dòng)主要受蛻皮激素的調(diào)控, CYP4家族在蛻皮激素20E代謝中發(fā)揮著重要作用, 是生長蛻皮相關(guān)基因(Simpson, 1997; Gilbert, 2009)。Aragon等(2002)發(fā)現(xiàn)CYP4C15基因在小龍蝦Y-器官中顯著表達(dá), 岸蟹表皮部位的CYP4C39與蛻皮激素降解有關(guān)(Rewitz, 2003), 夏西超等(2012)發(fā)現(xiàn)KK-42可顯著抑制凡納濱對(duì)蝦血淋巴CYP4V18表達(dá), 并可誘導(dǎo)蛻皮激素20E的濃度升高。鑒于鹽度對(duì)蛻皮活動(dòng)的影響以及CYP4家族基因在蛻皮激素代謝中發(fā)揮的重要作用, 本研究探討了鹽度與CYP4C基因的相關(guān)性, 結(jié)果顯示: 低鹽脅迫下能夠顯著降低CYP4C基因在三疣梭子蟹肝胰腺中的表達(dá), 并于6h之后達(dá)到穩(wěn)定的低水平狀態(tài); 高鹽脅迫下, 24h之內(nèi), CYP4C的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組, 之后略有下降。說明CYP4C能夠適應(yīng)鹽度變化, 其表達(dá)量隨鹽度變化波動(dòng)并于一定時(shí)間達(dá)到穩(wěn)定。推斷在高鹽條件下誘導(dǎo)表達(dá), 抑制蛻皮激素的合成, 延長蛻皮周期; 而低鹽能顯著降低CYP4C的表達(dá)量, 誘導(dǎo)蛻皮激素的合成, 提高蛻皮率。

本研究首次成功克隆了三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全長, 通過分析急性鹽度脅迫下的三疣梭子蟹肝胰腺中CYP4C基因的表達(dá)特征, 可以進(jìn)一步認(rèn)定CYP4C參與了三疣梭子蟹的鹽度適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程, 推斷CYP4C是鹽度影響蛻皮的重要調(diào)控因子之一, 為深入研究三疣梭子蟹CYP4C基因在甲殼動(dòng)物蛻皮機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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CLONING AND EXPRESSION OF CYP4C GENE IN

ZHANG Xiao-Yan1, 2, LI Jian1, LIU Ping1, CHEN Ping1, SUN Ming1, 3, YANG Ai-Guo4

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Ocean University of Shanghai, Shanghai 201306, China; 3. Ocean University of China, Qingdao 266071, China; 4. Qingdao Huiquan Ocean Science and Technology Development Company Limited, Qingdao 266071, China)

A complete cDNA sequence of CYP4C gene inwas first cloned in RT-PCR and Smart-TMRace technology. The length of the CYP4C gene is 1888bp encoding a protein of 514 amino acids. Bioinformatics analysis deduced that the CYP4C gene protein molecular weight is 59.54kDa with a theoretical pI 8.08. The amino acid sequence has CYP conserved domains of helix K (ExxR) and heme-binding motif (FxxGxxxCxG). Blast analysis revealed that the similarities of CYP4C with,,,,,were 88%, 72%, 66%, 59%, 60%, 59%, respectively. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to assess the mRNA expression of CYP4C in different tissues and its expression level of CYP4C in salinity stress. The results show that CYP4C could be expressed in all tested tissues of, including hepatopancreas, muscle, eyes, gills, and heart, among them the highest expression level was observed in hepatopancreas, while the lowest in heart. The expression level of CYP4C was up-regulated distinctly in the hepatopancreasat salinity 45, and then gradually reduced with time to the level of control group after 48 h, while at salinity 11, the CYP4C expression dropped significantly below that of the control group 6 h later. The results imply that CYP4C is involved in the accommodation to salinity change and play an important role in its molting.

; CYP4C; gene cloning; expression; salinity stress

10.11693/hyhz2012122700121212272

* 國家863計(jì)劃課題, 2012AA10A409號(hào); 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目資助, 20603022012021號(hào)。張曉燕, 碩士研究生, E-mail: yanerzhang2006@163.com

李健, 研究員, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2012-12-27,

2013-03-15

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