GRP78對結(jié)直腸癌細胞RKO增殖的影響

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(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

GRP78對結(jié)直腸癌細胞RKO增殖的影響

劉麗麗，邢曉明

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

目的探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)對結(jié)直腸癌細胞RKO增殖的影響。方法通過脂質(zhì)體2000將靶向GRP78的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入RKO細胞,Western-blot方法檢測GRP78在RKO細胞中的表達，CCK-8方法檢測細胞的增殖能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染后,與對照組相比,RKO細胞GRP78蛋白表達明顯降低(F=115.17，q=5.41、15.29，P<0.05);同時，RKO細胞的增殖水平也明顯降低(F=45.60，q=11.16、12.17，P<0.05)。結(jié)論GRP78體外可促進結(jié)直腸癌增殖。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;結(jié)直腸腫瘤;細胞增殖

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78),也稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的熱休克蛋白70家族成員,具有保守的ATPase結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域[1]。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要分子伴侶之一，GRP78可以促進蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正確折疊與組裝，阻止錯誤折疊蛋白的蓄積，靶向降解錯誤折疊的蛋白，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。正常情況下，在正常成年人腦、肺、肝等器官組織中都有較低水平的GRP78表達，但當腫瘤發(fā)生時，GRP78的表達明顯增高。近年來隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾技術(shù)的不斷進步，關(guān)于GRP78在腫瘤中作用的研究越來越深入。研究表明,GRP78可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲能力以及對抗癌藥物的耐受性,被視為腫瘤治療反應的一種生物標志[3-4]。本文通過靶向GRP78的干擾質(zhì)粒來抑制RKO細胞系GRP78蛋白的表達，觀察GRP78對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞 人結(jié)直腸癌RKO細胞由浙江大學醫(yī)學院分子病理學實驗室提供。

1.1.2主要試劑 胎牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司，LB液體培養(yǎng)基由青島大學醫(yī)學院病原微生物學教研室提供，高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根科技生物有限公司；兔抗人GRP78一抗購自美國Abcame公司，兔抗人β-actin一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司，細胞轉(zhuǎn)染試劑及OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，細胞增殖CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。

1.1.3主要儀器 熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)，紫外線分光光度計、酶聯(lián)免疫檢測儀及4 ℃低溫離心機(徳國Eppendorf公司)。

1.2實驗方法

1.2.1質(zhì)粒的抽提 質(zhì)粒表達載體由上海吉瑪公司構(gòu)建, RNA干擾靶序列為5′-GCGCATTGATA-CTAGAAATGA-3′[5],靶向GRP78的質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒大腸桿菌菌液保存于青島大學醫(yī)學院病原微生物學教研室。按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行抽提，質(zhì)粒儲存于-20 ℃冰箱，用于細胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 RKO細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)于含體積

分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，次日細胞的融合率達到90%左右，接種后24 h以內(nèi)按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染[5]。實驗分為3組：實驗組，轉(zhuǎn)染時加入脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及靶向GRP78質(zhì)粒; 陰性對照組，轉(zhuǎn)染時加入脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及陰性對照質(zhì)粒；空白對照組,轉(zhuǎn)染時只加入脂質(zhì)體Lipofectamine 2000。

1.2.3Western-blot檢測GRP78蛋白的表達水平提取3組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,以脫脂奶粉室溫封閉。加入一抗(β-actin為1∶1 000，GRP78為1∶200)4 ℃孵育過夜，然后使用TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)搖床室溫孵育2 h，再用TBST洗膜，最后加入ECL化學發(fā)光劑，采用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。

1.2.4體外細胞增殖實驗 采用CCK-8檢測3組細胞的體外增殖能力。取對數(shù)生長期的細胞接種到96孔板中，每組設5個復孔，每孔接種4 000個細胞。細胞接種后48 h,每孔加入10 μL的CCK-8，放入37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，酶聯(lián)免疫檢測儀于波長450 nm處測量各孔的吸光度(A)值，實驗重復3次，取均值。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1各組細胞GRP78蛋白表達量比較

Western-blot檢測的結(jié)果顯示，以β-actin為參照，實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞GRP78蛋白的相對表達量分別為0.32±0.15、1.14±0.03、1.03±0.05，實驗組細胞GRP78蛋白的相對表達量與另兩組比較差異有顯著性(F=115.17，q=5.41、15.29，P<0.05)。與陰性對照組比較，實驗組細胞GRP78蛋白表達抑制率達70%以上。

2.2GRP78對各組細胞增殖的影響

細胞接種48 h后,空白對照組、陰性對照組、實驗組細胞的增殖水平分別為0.78±0.05、0.80±0.03、0.56±0.01,與對照組相比較，實驗組細胞的增殖能力明顯降低(F=45.60，q=11.16、12.17，P<0.05)。

3 討 論

GRP78 也稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白, 是定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的熱休克蛋白70家族成員之一[1]。GRP78具有多種生物學功能。作為分子伴侶，GRP78靶向降解錯誤折疊的蛋白，促進蛋白質(zhì)的折疊和組裝，保持應激狀態(tài)下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[2]；作為Ca2+結(jié)合蛋白，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的平衡；應激情況下，如低氧、酸中毒以及Ca2+內(nèi)流紊亂等均可導致錯誤折疊蛋白的聚集，引起GRP78表達升高，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定[2]。血管化不良引起腫瘤內(nèi)存在低糖、低氧及酸中毒等應激微環(huán)境，從而啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引起GRP78表達，以利于腫瘤細胞的存活[7]。

細胞增殖調(diào)控發(fā)生嚴重紊亂會導致腫瘤的發(fā)生。JAMORA等[8]研究結(jié)果顯示，敲除GRP78的纖維肉瘤細胞在動物接種成瘤實驗中不能形成腫瘤，證實GRP78為腫瘤生長所需要。DONG等[9]建立GRP78基因雜合子(Grp78+/)小鼠模型，發(fā)現(xiàn)盡管雜合子小鼠GRP78的表達明顯降低，但并不影響小鼠器官發(fā)育及抗體形成。然而體內(nèi)接種腫瘤細胞以后，GRP78表達下降可明顯延長腫瘤發(fā)生的潛伏周期，抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡，并抑制腫瘤血管生成。GRP78通常定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，但在細胞表面也有分布，可將細胞外的信號刺激轉(zhuǎn)為細胞內(nèi)的信號，從而促進腫瘤的發(fā)展。有研究顯示，GRP78在1-LN前列腺癌細胞表面高表達，并通過與活化的蛋白激酶抑制劑α2M結(jié)合，激活細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導通路，從而促進腫瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡[10]。

通過免疫組織化學方法，劉芳等[11]研究顯示， GRP78在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤，證實GRP78表達升高與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)。王麗麗等[5]通過短發(fā)夾狀RNA成功抑制結(jié)直腸癌細胞系GRP78蛋白的表達，為本實驗奠定了基礎。本研究通過抑制GRP78在結(jié)直腸癌細胞系RKO中的表達，探討GRP78在結(jié)直腸癌細胞增殖過程中所起的作用。結(jié)果表明，靶向GRP78蛋白的質(zhì)?？梢燥@著下調(diào)結(jié)直腸癌細胞GRP78蛋白的表達。細胞接種后48 h, GRP78的表達降低可以顯著抑制細胞的增殖。

目前研究表明, GRP78在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮重要作用。SU等[12]研究顯示，在肝癌細胞系中GRP78的過度表達不管在體內(nèi)和體外都能促進肝癌細胞的侵襲性，這一過程是通過增強黏著斑激酶(FAK)的激活和活性實現(xiàn)的。降低GRP78的表達可以使FAK的磷酸化水平降低，從而使肝細胞癌的侵襲性降低。

在異種移植模型中，抗血管形成因子的使用可以引起GRP78的轉(zhuǎn)錄，增加GRP78蛋白的表達[4]。因此，在目前腫瘤治療基礎上，敲除內(nèi)源性GRP78蛋白的表達，有利于清除殘存的腫瘤細胞，為腫瘤的治療提供新的方向。

總之，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，GRP78可以發(fā)揮上述多重生物學功能。在本研究中，我們通過RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌RKO細胞系GRP78蛋白的表達，并通過CCK-8檢測干擾前后細胞系的增殖能力，研究結(jié)果表明，GRP78表達的降低可以抑制RKO細胞的體外增殖能力。因此，在體外，GRP78可促進結(jié)直腸癌的增殖，但具體的機制還有待于進一步研究。

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(本文編輯 厲建強)

THEINFLUENCEOFGRP78ONPROLIFERATIONOFCOLORECTALCARCINOMACELLRKO

LIULili,XINGXiaoming

(Department of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the influence of GRP78 on proliferation of colorectal carcinoma cell RKO.MethodsPlasmid with targeted GRP78 was transfected into RKO cells by Lipofectamine 2000, Western-blot method was used to detect the expression of GRP78 protein in RKO cells, and cell proliferation ability was measured using CCK-8 assay.ResultsAfter the transfection, the expression of GRP78 protein in RKO cells was significantly declined versus the control group (F=115.17;q=5.41,15.29;P<0.05), and the proliferation of RKO cells significantly decreased as well (F=45.60;q=11.16,12.17;P<0.05).ConclusionGRP78, in vitro, can promote the proliferation of colorectal carcinoma.

glucose regulated protein 78; colorectal neoplasms; cell proliferation

2014-01-18;

2014-03-24

國家自然科學基金資助項目(81201947)；山東省自然科學基金資助項目(ZR2009CM014)

劉麗麗(1988-),女,在讀碩士研究生。

邢曉明(1977-),女,博士,副主任醫(yī)師,碩士生導師。

R735.3

A

1008-0341(2014)03-0199-03