五味子乙素對(duì)乳鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

劉 威,張成義,沈 楠,金 宏,袁 瑞,萬曉明,齊 玲

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,吉林吉林 132013;2.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,吉林吉林132001; 3.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室,吉林吉林 132013)

五味子乙素對(duì)乳鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

劉 威1,張成義2,沈 楠1,金 宏1,袁 瑞1,萬曉明1,齊 玲3

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,吉林吉林 132013;2.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,吉林吉林132001; 3.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室,吉林吉林 132013)

目的:探討五味子乙素(Sch B)預(yù)處理對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的影響,并探討其可能機(jī)制。方法:分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞,將其分為對(duì)照組、模型組和10、50、250 mg·L－1Sch B預(yù)處理組,除對(duì)照組外各組細(xì)胞采用2 mmol·L－1Na2S2O4培養(yǎng)2 h后換用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h,造成心肌細(xì)胞H/R損傷。倒置顯微鏡觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,檢測(cè)各組細(xì)胞中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平。結(jié)果:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞明顯回縮、停搏或浮起,細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.01),LDH和CK活性及MDA水平升高(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);與模型組比較,SchB預(yù)處理各組細(xì)胞博動(dòng)尚存,回縮較輕,細(xì)胞存活率明顯升高(P＜0.01), LDH和CK活性及MDA水平降低(P＜0.01),SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:Sch B對(duì)乳鼠H/R損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

五味子乙素;心肌細(xì)胞;缺氧/復(fù)氧損傷;抗氧化

心肌缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷是指H/R心肌在恢復(fù)血運(yùn)后原損傷反而加重,一般發(fā)生于再灌注后24 h內(nèi)。H/R損傷常導(dǎo)致心律失常、心肌舒縮功能障礙、代謝異常以及心肌超微結(jié)構(gòu)改變[1]。隨著血管再通技術(shù)的迅速開展,心肌H/R損傷成為影響療效和阻礙治療的最主要原因,如何減輕H/R損傷成為醫(yī)學(xué)界新的挑戰(zhàn)[2]。有文獻(xiàn)[3-6]報(bào)道:五味子各成分具有抗心肌H/R損傷作用,但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)制備原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞H/R損傷模型,檢測(cè)其乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平,探討五味子乙素(schizandrin B,Sch B)對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能機(jī)制,為新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器出生72 h內(nèi)的SD大鼠,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK-吉2007-0003。Sch B(中國藥品生物制品檢定所),DMEM粉劑培養(yǎng)基(美國Gibco公司),MTT和胰蛋白酶(美國Sigma公司),新生牛血清(四季青公司產(chǎn)品),LDH試劑盒、CK試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。CO2培養(yǎng)箱(美國Shell公司), Motic AE37攝像倒置顯微鏡和860型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)取新生72 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠4～8只,剪取心臟,冷PBS溶液沖洗3次,50 m L離心管中剪碎。PBS沖洗2次, 以0.25%胰蛋白酶37℃消化8 min,收集上清,用血清終止消化,反復(fù)消化至組織塊消化完全。整個(gè)消化過程控制在1.5～2.0 h內(nèi)。收集液以200目濾網(wǎng)過濾,1 000 r·min－1離心5 min,去上清,重懸,差速貼壁90 min純化細(xì)胞后調(diào)整密度為1×105～1×106m L－1,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中, 96孔板每孔200μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法對(duì)照組:細(xì)胞正常培養(yǎng),不加任何處理;模型組:將正常培養(yǎng)液換為終濃度為2 mmol·L－1的Na2S2O4溶液,細(xì)胞缺氧培養(yǎng)2 h后換正常DMEM培養(yǎng)液即造成H/R損傷,CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)18 h。不同濃度Sch B預(yù)處理組:在培養(yǎng)液中加入終濃度為10、50和250 mg·L－1Sch B溶液預(yù)培養(yǎng)24 h后同模型組處理。

1.4 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞的生長狀態(tài),包括細(xì)胞貼壁情況、伸展程度、搏動(dòng)的頻率和同步性。

1.5 MTT比色法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率各組心肌細(xì)胞PBS清洗2次,加入無血清的培養(yǎng)液及20μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒板后每孔加入150μL二甲基亞砜,震板10 min,酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組A值/正常組A值×100%。

1.6 心肌細(xì)胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平測(cè)定各組心肌細(xì)胞H/R損傷后,按照試劑盒說明書操作,取培養(yǎng)液上清,測(cè)定LDH漏出量及CK活性。取各組細(xì)胞,經(jīng)超聲波破碎儀(功率300 W,工作時(shí)間3 s,間隔時(shí)間30 s,重復(fù)5次)將其破碎,按試劑盒說明操作,測(cè)定胞漿中MDA水平和SOD活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率,LDH、CK、SOD活性和MDA水平以±s表示,多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與對(duì)照組(圖1A,見插頁三)比較,模型組細(xì)胞體積回縮明顯,僅少數(shù)細(xì)胞搏動(dòng)30～40次·min－1,搏動(dòng)不規(guī)則甚至停止,有大量單個(gè)細(xì)胞浮起甚至部分區(qū)域細(xì)胞層浮起,表明細(xì)胞損傷嚴(yán)重(圖1B,見插頁三)。與模型組比較,Sch B預(yù)處理各組的心肌細(xì)胞H/R損傷后,隨藥物濃度增加心肌細(xì)胞形態(tài)變化不同程度減輕;250 mg·L－1Sch B預(yù)處理組細(xì)胞輕度回縮,偽足尚存,搏動(dòng)90～110 min－1,頻率較規(guī)整,同步性較好,無細(xì)胞浮起或細(xì)胞層脫落(圖1C,見插頁三);50 mg·L－1組細(xì)胞回縮較明顯,部分細(xì)胞偽足消失,細(xì)胞連接減少,搏動(dòng)80～100 min－1,出現(xiàn)不規(guī)律搏動(dòng),無細(xì)胞浮起或脫落(圖1D,見插頁三);10 mg·L－1Sch B預(yù)處理組細(xì)胞回縮明顯,較多偽足消失,搏動(dòng)約為70 min－1,有較多不規(guī)則搏動(dòng),同步性較50和250 mg·L－1預(yù)處理組差(圖1E,見插頁三)。

2.2 各組心肌細(xì)胞存活率與對(duì)照組(95.75%± 2.62%)比較,模型組心肌細(xì)胞存活率(70.67%± 2.55%)明顯下降(P＜0.01),細(xì)胞損傷嚴(yán)重;與模型組比較,10、50和250 mg·L－1Sch B預(yù)處理組細(xì)胞存活率(78.43%±3.53%、83.64%± 2.03%和89.77%±3.42%)均明顯上升(P＜0.01)。上述結(jié)果表明10～250 mg·L－1Sch B對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷有保護(hù)作用,且呈濃度依賴性。

2.3 各組心肌細(xì)胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平模型組細(xì)胞H/R損傷嚴(yán)重,與對(duì)照組比較,LDH和CK活性及MDA水平明顯升高(P＜0.01),SOD活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,Sch B預(yù)處理各組LDH和CK活性及MDA水平明顯降低(P＜0.01),SOD活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);10、50和250 mg·L－1Sch B預(yù)處理組隨著Sch B濃度增加LDH和CK活性及MDA水平明顯下降(P＜0.05),SOD活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平Tab.1 Activities of LDH,CK and SOD and MDA levels in myocardial cells in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with model group;＃P＜0.05,＃＃P＜0.01 compared with 10 mg·L－1Sch B group;▲P＜0.05 compared with 50 mg·L－1Sch B group.

Group LDH [λB/(U·L－1)] CK [λB/(U·m L－1)] SOD [λB/(U·mg－1prot)] MDA [mB/(μmol·g－1prot)] Control 123.20±18.84 0.37±0.03 20.97±2.29 2.48±0.40 Model 425.89±22.98?0.60±0.07?10.17±1.83?5.45±0.32?Sch B(mg·L－1) 10 350.65±33.25△△0.49±0.02△△12.03±1.87△4.84±0.30△△50 260.54±30.69△△＃0.44±0.02△△＃14.43±1.46△△＃4.18±0.15△△＃250 203.16±9.78△△＃▲0.41±0.01△△?！?7.20±1.16△△＃?！?.86±0.33△△?！?/p>

3 討論

心肌組織的有氧代謝與線粒體功能關(guān)系密切。研究[7-9]表明:缺血再灌注、活性氧的積累和鈣超載等情況均可造成線粒體膜通透性增高和酶外漏,使其功能下降或喪失,引起細(xì)胞壞死。LDH是線粒體內(nèi)重要酶,其水平改變會(huì)干擾心肌細(xì)胞正常代謝,造成心肌細(xì)胞大量損傷和死亡,其漏出量多少直接反映細(xì)胞損傷程度,因此可將其作為反映心肌細(xì)胞損傷程度有效指標(biāo)[10]。CK是人體能量代謝過程中的重要酶類,通常存在于骨骼肌和心肌組織細(xì)胞漿和線粒體中。正常情況下,血清CK活性很低,當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí),細(xì)胞膜遭到破壞,CK可從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,臨床上常以CK及其同功酶作為骨骼肌和(或)心肌損害敏感指標(biāo)[11]。在心肌缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中,自由基(oxygen free radical,OFR)引起的損傷起著關(guān)鍵作用。許多缺血性心臟疾病如心肌梗死和心力衰竭發(fā)生時(shí),大量氧自由基可導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,膜結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞滲透性改變,引起心肌細(xì)胞凋亡和壞死[12-14]。機(jī)體為了對(duì)抗氧自由基對(duì)自身的損傷,形成了完整的氧自由基清除系統(tǒng),其主要成分是機(jī)體中的抗氧化酶。SOD是這個(gè)清除系統(tǒng)中重要的抗氧化酶,其活性高低可反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力[15]。正常狀態(tài)下氧自由基生成系統(tǒng)與清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)組織細(xì)胞受到損傷時(shí),該動(dòng)態(tài)平衡被破壞,因?yàn)锳TP等能量物質(zhì)大量耗竭可使該酶系遭到破壞,清除能力降低,大量來不及清除的OFR聚積;再灌注時(shí),造成氧自由基爆發(fā)性釋放,嚴(yán)重影響物質(zhì)代謝,損害機(jī)體,引起疾病[10]。OFR還可攻擊細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸,生成多種脂質(zhì)過氧化物,如MDA等大量細(xì)胞毒性物質(zhì)。MDA對(duì)細(xì)胞膜有很強(qiáng)破壞作用,使其流動(dòng)性降低和通透性增高,細(xì)胞內(nèi)外離子分布發(fā)生異常,影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),抑制心肌細(xì)胞功能,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞從可逆性損傷發(fā)展為細(xì)胞死亡,故MDA可作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)[16-17]。

本研究結(jié)果顯示:H/R損傷后模型組培養(yǎng)液中LDH和CK活性明顯增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與細(xì)胞膜破壞導(dǎo)致其外漏有關(guān); 10、50和250 mg·L－1SchB預(yù)處理組培養(yǎng)液中LDH和CK活性明顯下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明Sch B預(yù)處理可減輕細(xì)胞損傷,其機(jī)制與保護(hù)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,模型組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高,說明心肌細(xì)胞清除氧自由基能力嚴(yán)重下降,大量氧自由基對(duì)細(xì)胞劇烈攻擊,產(chǎn)生了大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷;與模型組比較,10、50和250 mg·L－1Sch B預(yù)處理組SOD活性均明顯升高,MDA水平明顯下降,說明Sch B預(yù)處理可減輕心肌細(xì)胞氧化損傷。

綜上所述,Sch B對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制與其保護(hù)心肌細(xì)胞膜完整性、減少LDH和CK的外漏、提高SOD活性、減少M(fèi)DA的生成,從而減輕細(xì)胞氧化損傷,使心肌細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)的作用有關(guān)。因此,Sch B可以作為保護(hù)心肌細(xì)胞的新藥進(jìn)行開發(fā),但其對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞保護(hù)作用的其他機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Protective effect of Schisandrin B on myocardial cells with hypoxia/reoxygenation-induced injury in neonatal rats and its mechanism

LIU Wei1,ZHANG Cheng-yi2,SHEN Nan1,JIN Hong1,YUAN Rui1,WAN Xiao-ming1,QI Ling3
(1.Experimental Center,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Department of Pharmacology, School of Pharmacy,Beihua University,Jilin 132001,China;3.Department of Pathology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo investigate the influence of Schizandrain B(Sch B)preconditioning in myocardial cells of neonatal rats with hypoxia/reoxygenation(H/R)injury,and to explore its possible mechanism.MethodsThe cultured myocardial cells were divided into control group,model group and 10,50,250 mg·L－1SchB preconditioning groups.All the cells in various groups except control group were cultured in 2 mmol·L－1Na2S2O4for 2 h,then cultured in normal medium for 18 h to induce myocardial H/R injury.The morphological changes of myocardial cells in various groups were observed under inverted microscope.The survival rates of the myocardial cells in each group were examined by MTT.The activities of lactic dehydrogenase(LDH),creatine(CK), superoxide ismutase(SOD),and the(MDA)levels in the cells in various groupswere examined by detection kits.ResultsCompared with control group,the cells in model group were retracted,arrest or float,the survival rate was decreased significantly(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA level were increased(P＜0.01),andthe SOD activity was decreased(P＜0.01);compared with model group,the cells in Sch B preconditioning groups remained beating,retraction was light,the cell survival rates were significantly increased(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA levels were decreased(P＜0.01),and the SOD activities were increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionSch B has protective effect on myocardial cells with H/R injury in the neonatal rats,which may be associated with anti-oxidative damage.

Schisandrin B;myocardial cells;hypoxia/reoxygenation injury;anti-oxygenation

R285.5

A

2013-09-25

吉林省教育廳科研基金資助課題(2011281,2012330,2012329)

劉 威(1976－),女,吉林省吉林市人,助理實(shí)驗(yàn)師,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的研究。

齊 玲(Tel:0432-64560027,E-mail:qiling1718＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0977-04

10.13481/j.1671-587x.20140514