阿霉素腎病動物模型的研究進展

郭繼光，白楊，周廣濱

（1.河北大學醫(yī)學部微生物學教研室，河北保定071002；2.河北大學公共外語教研部，河北保定071002；3.高碑店市醫(yī)院神經外科，河北高碑店074000）

阿霉素腎病動物模型的研究進展

郭繼光1，白楊2，周廣濱3

（1.河北大學醫(yī)學部微生物學教研室，河北保定071002；2.河北大學公共外語教研部，河北保定071002；3.高碑店市醫(yī)院神經外科，河北高碑店074000）

阿霉素；動物模型；局灶節(jié)段性腎小球硬化癥；慢性腎病

大多數(shù)慢性腎病的特征是出現(xiàn)腎小球硬化癥、腎小管間質炎癥和纖維化。阿霉素是一種經典的嚙齒類腎炎損傷誘發(fā)劑，能夠引發(fā)初期局灶節(jié)段性腎小球硬化癥，可很好地模擬人體的慢性腎炎狀況。1970年Sternberg首次報道蒽環(huán)類抗生素能夠引起腎炎［1］。阿霉素誘導的大鼠腎炎模型在1976年首次被報道［2］，之后小鼠的阿霉素腎炎模型在1998年被報道［3］。1977年，Burke等［4］報道了1例78歲老人在使用阿霉素后產生了腎功能衰竭癥狀。從此，阿霉素腎炎大鼠模型就引起了學者們廣泛和深入的研究，以進一步揭示腎臟損傷的病理機制。

1 阿霉素腎炎動物模型的優(yōu)缺點

阿霉素腎炎作為一種腎炎實驗模型有許多優(yōu)點。該模型的典型特征是用藥幾天之內就發(fā)生腎臟的嚴重損傷，機體體質量減輕，但損傷發(fā)生的時段很穩(wěn)定，而且可以預料，因此死亡率較低（5%）［5］。這種損傷的狀況和發(fā)生時間的可預見性，使其成為檢測腎臟損傷惡化或者減輕的合適模型。該模型損傷的結構和功能與人類慢性蛋白尿腎病的狀況非常近似。此外，該模型在大鼠和小鼠中的情況也相似［6］。目前有許多病理學研究都使用了阿霉素誘導的腎炎動物模型［7－8］，表明嚙齒類模型對科學研究是十分便利的。

但該模型的應用也存在一些不足。不同批次的阿霉素的效果存在波動。在使用中常常會碰到某些批次的阿霉素腎臟損傷效果低下導致造模失敗的情況。所以通常購買到新的批次阿霉素時，最好先測試一下藥效再大量使用。由于模型的制作要求操作人員具備一定的技術，對初學者具有一定的難度。一般來說，多數(shù)采用大鼠尾靜脈注射藥物，需要注意掌握一些技巧，比如，注射過程中可以使用白熾燈溫暖尾巴以維持血管的舒張狀態(tài)。另外，未經麻醉的大鼠尾靜脈注射效果更明顯，但大鼠的掙扎增加了操作難度，因此需要兩名操作者配合完成注射。阿霉素的治療濃度范圍較窄，使用的劑量偏大或者偏小0.5mg／kg，就能導致動物死亡或者腎臟損傷不足。即使模型制作使用穩(wěn)定的批次、操作妥當且用藥劑量精確，還有最后一道關卡就是個體差異。有時候，同一批同品種的大鼠之間也存在較大的個體差異，甚至導致造模失敗。實驗動物的不同種系對阿霉素的敏感性存在差異，也使得該模型的應用受到限制。盡管存在上述問題，該模型用于慢性腎病的研究仍具備很多便利因素，并有助于進一步揭示慢性腎病的發(fā)病機制和治療方法。

2 阿霉素腎炎動物模型的藥代動力學機制

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，同時也是使用廣泛的人類抗腫瘤藥物。道諾霉素和阿霉素是最早出現(xiàn)的兩種蒽環(huán)類抗生素，在20世紀60年代即投入生產。人們已經詳盡地研究了它們在人類和動物體內的藥物代謝動力學，并發(fā)現(xiàn)它們存在一些差異。阿霉素進入機體后，血漿清除快并且有顯著的組織結合，主要由肝臟進行代謝。人體通過尿液5 d能排出4%～5%的阿霉素，通過膽汁7 d內排出給藥量的40%～50%［9］。大鼠和小鼠接受靜脈給藥后，阿霉素會從血漿中快速清除，在組織中沉積，并能夠經過尿液和膽汁緩慢排泄。阿霉素代謝緩慢，主要累積在腎臟，部分見于肝臟、心臟和小腸［10］。這可能是阿霉素比道諾霉素具有更強的腎臟毒性和更廣泛的治療指數(shù)的原因。

3 阿霉素腎炎動物模型的給藥方式

3.1 動物品系

一般根據大小鼠具體的種系、雌雄、年齡、來源和批次，選擇阿霉素最佳給藥方式。多數(shù)品種的大鼠對阿霉素腎臟損傷十分敏感。雄性Wistar大鼠的阿霉素有效劑量范圍在1.5～7.5 mg／kg［11］。BALB／c小鼠需要9.8～10.4 mg／kg，而雄性BALB／c SCID小鼠（一種淋巴細胞被敲除的BALB／c近交系小鼠）僅需要5.3 mg／kg［12］。C57BL／c小鼠對阿霉素導致的腎臟損傷具有高度的抗性，但高劑量（13～25 mg／kg）能夠誘導腎損傷［13－15］。

3.2 給藥方式和途徑

在多數(shù)的研究中都是進行單次注射，但是也存在其他的多種給藥方式（20 d內每2天注射2 mg／kg，7 d內每天注射1 mg／kg，14 d內每隔6 d注射2.5 mg／kg）。靜脈注射是最常用的給藥途徑，包括尾靜脈、陰莖靜脈［16］、股靜脈［17］和臀靜脈［18］，但以尾靜脈最常見。尾靜脈注射的主要問題是組織液外滲導致的表皮壞死。阿霉素的治療劑量范圍十分狹窄，因此操作上的微小計量的偏差就能夠導致相當?shù)乃幮Р町?。另外一個給藥途徑是胸部心臟直接注射，如雄性的Wistar大鼠可注射7 mg／kg［19］，但是需要事先進行麻醉。腎臟直接注射阿霉素結合對側腎臟切除手術，可以在4周內誘發(fā)腎臟損傷。直接通過腎臟動脈給藥的方式只在研究藥物動力學時對狗實施過［20］。盡管有關這些方法有報道說比較安全，但是心臟和腎臟直接給藥的方式會產生較大的損傷，因而限制了它們的廣泛使用。大多數(shù)研究在選用小鼠造模時，多選擇便捷的腹腔給藥途徑［21］，但是由于腹膜吸收的差異性，導致該方法不如靜脈注射的效果穩(wěn)定。

3.3 影響因素

阿霉素運送到靶器官的過程可能會受到多種因素的影響。暫時性的切斷一側腎動脈，能夠保護靜脈注射阿霉素時對該側腎臟的損傷［22］。另外，NO對血流的抑制能夠阻止腎小球腎炎的發(fā)生。這些研究也證明了阿霉素對于腎臟的損傷是通過與腎臟直接作用而誘發(fā)的［23］。雄性大鼠比雌性大鼠對阿霉素誘導的腎病更加敏感。閹割的雄性大鼠比起假手術的雄性大鼠對阿霉素的易感性降低［24］。由于腎臟損傷的嚴重程度存在差異，在考慮用阿霉素腎病作為腎臟損傷模型進行實驗設計時，雌雄的選擇也是一個重要因素。

4 阿霉素腎炎動物模型主要特征

阿霉素腎病動物模型中的組織改變與人類局灶節(jié)段性腎小球硬化癥相類似，包括足細胞損傷以及隨后發(fā)生的腎小球硬化癥、腎小管間質炎癥和纖維化［25］。阿霉素導致的腎小球上皮變薄和足細胞的消失會降低腎臟對血漿蛋白質的濾過功能［13］。這些變化在阿霉素注射后1～2周就能觀察到，在第4周時相當明顯。腎功能的變化和慢性腎病特征相一致，包括血液肌酐含量增加、肌酐清除率下降、清蛋白減少、脂代謝紊亂、蛋白尿。進一步的組織化學檢查表明，損傷后的腎臟出現(xiàn)嚴重的腎間質炎癥，并可見大量的T細胞、B細胞和巨噬細胞浸潤［25］。在阿霉素損傷后的腎皮質和髓質中，CD4＋和CD8＋細胞數(shù)目明顯增加。這種T細胞的增多僅在腎臟中出現(xiàn)，而在脾臟中未出現(xiàn)，說明這些細胞在調節(jié)腎臟損傷的過程中起直接作用。

4.1 基因易感性

阿霉素腎病的易感性是品系特異的，例如，BALB／c小鼠對阿霉素高度敏感，而C57BL／6小鼠則具有高度耐受性［11］。通過繁育實驗已經發(fā)現(xiàn)了一個和阿霉素腎病易感性有關的基因座，位于16號染色體，屬于隱性遺傳。與易感性有關的基因座的等位基因與8號染色體上的蛋白精氨酸甲基化轉移酶（protein arginine methyltransferase）的表達抑制有關，而該蛋白又與化療試劑的細胞敏感性有關［26］。此外，遺傳背景的不同對阿霉素腎病的發(fā)病程度有明顯影響。研究表明8號染色體上的一個基因座與腎病發(fā)展程度和嚴重性相關［26］。

最近的研究表明，機體對阿霉素的易感性與免疫系統(tǒng)的差異有關。例如，BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠的Th1／Th2模式存在差異，C57BL／6小鼠的免疫反應更傾向于Th1類型，而BALB／c小鼠則與之相反。因此C57BL／6的免疫系統(tǒng)對細胞內感染的準備更足，從而獲得了更強的抵抗性。有研究對不同品系的小鼠與阿霉素腎病的易感性進行了總結［27］，其中易感的小鼠品系包括BALB／Cj、129sVj、129s1／sViMj和BALB／CbYj，有抗性的品系包括C57BL6／J、FVB／NJ、CAST／EiJ、AKR／J、C3H／HeJ、CBA／J、C57BL／10J、LP／J、SWR／J、SJL／J和129S6／SvEvTac。

4.2 發(fā)病機制

阿霉素通過對腎小球的直接毒性損傷以及隨后的腎小管間質損傷誘發(fā)腎病。阿霉素對腎小球濾過屏障各個組成部分（腎小球內皮細胞、基底膜和足細胞）均可造成影響。阿霉素還能導致多糖包被厚度減小、腎小球血管內皮細胞的孔隙增大、腎小球電荷選擇性減少以及足細胞的足突融合。腎小球內皮細胞產生的蛋白多糖包被是由蛋白聚糖和黏多糖組成，其減少與上述的腎小球濾過屏障的改變相關［13］。研究表明阻斷腎動脈能夠使腎臟免受阿霉素的損傷，證明阿霉素腎病的產生是阿霉素直接作用于腎臟所致［22］。

進一步的研究已經深入到阿霉素誘導的腎臟損傷的分子機制中，自由基的增多已被提出作為其中的一個發(fā)病機制。通過隔離灌注研究八目鰻（Myxine glutinosa）腎小球的結果支持了這一觀點；在此研究中發(fā)現(xiàn)阿霉素能夠降低腎小球ATP酶活性，從而引起透水性的下降，這一作用可以被巰基供體N-乙酰半胱氨酸（sulfhydryl donor N-acetylcysteine）逆轉［28］。此外，阿霉素會導致肝臟、腎臟和心臟中的谷胱甘肽（一種抗氧化劑）耗竭，而脂類過氧化物水平升高［29］。

晚期糖基化終末產物也參與了阿霉素的發(fā)病機制。研究發(fā)現(xiàn)阿霉素不會導致RAGE敲除小鼠的足細胞損傷和蛋白尿。進一步的研究表明，阿霉素會誘導產生RAGE配體，而RAGE配體參與了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸化酶和p44／p42 MAP激酶信號的激活，并引起促纖維化生長因子的上調［30］。

［1］ Sternberg SS.Cross-striated fibrils and other ultrastructural alterations in glomeruliof ratswith daunomycin nephrosis［J］.Lab Invest，1970，23（1）：39－51.

［2］ Bucciarelli E，Binazzi R，Santori P，et al.Nephrotic syndrome in rats due to adriamycin chlorhydrate［J］.Lav Ist Anat Istol Patol Univ Studi Perugia，1976，36（2）：53－69

［3］ Chen A，Sheu LF，Ho YS，et al.Experimental focal segmental glomerulosclerosis in mice［J］.Nephron，1998，78（4）：440－452.

［4］ Burke JJ，Laucius JF，Brodovsky HS，et al.Doxorubicin hydrochloride-associated renal failure［J］.Arch Intern Med，1977，137（3）：385－388.

［5］ Pippin JW，Brinkkoetter PT，Cormack-Aboud FC，et al.Inducible rodentmodels of acquired podocyte diseases［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2009，296（2）：F213－F229.

［6］ Weiss RB.The anthracyclines：will we ever find a better doxorubicin［J］？Semin Oncol，1992，19（6）：670－686.

［7］ De Mik SM，Hoogduijn MJ，de Bruin RW，et al.Pathophysiology and treatmentof focal segmental glomerulosclerosis：the role of animalmodels［J］.BMC Nephrol，2013，14：74.

［8］ Takiue K，Sugiyama H，Inoue T，et al.Acatalasemic mice are mildly susceptible to adriamycin nephropathy and exhibit increased albuminuria and glomerulosclerosis［J］.BMCNephrol，2012，13：14.

［9］ Takanashi S，Bachur NR.Adriamycin metabolism in man.Evidence from urinary metabolites［J］.Drug Metab Dispos，1976，4（1）：79－87.

［10］ Yesair DW，Schwartzbach E，Shuck D，etal.Comparative pharmacokinetics of daunomycin and adriamycin in several animal species［J］.Cancer Res，1972，32（6）：1177－1183.

［11］ Cao Q，Wang Y，Zheng D，et al.IL-10／TGF-betamodified macrophages induce regulatory T cells and protect against adriamycin nephrosis［J］.JAm Soc Nephrol，2010，21（6）：933－942.

［12］ Lee VW，Wang Y，Qin X，et al.Adriamycin nephropathy in severe combined immunodeficient（SCID）mice［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21（11）：3293－3298.

［13］ Jeansson M，Bjorck K，Tenstad O，et al.Adriamycin alters glomerular endothelium to induce proteinuria［J］.JAm Soc Nephrol，2009，20（1）：114－122.

［14］ Hayashi K，Sasamura H，Ishiguro K，et al.Regression of glomerulosclerosis in response to transient treatment with angiotensinⅡblockers is attenuated by blockade of matrix metalloproteinase-2［J］.Kidney Int，2010，78（1）：69－78.

［15］ Heikkil?E，Juhila J，Lassila M，etal.β-Cateninmediates adriamycin-induced albuminuria and podocyte injury in the adult mouse kidneys［J］.Nephrol Dial Transplant，2010，25（8）：2437－2446.

［16］ Deelman LE，Navis G，de Boer E，et al.Role of proteinuria in the regulation of renal renin-angiotensin system components in unilateral proteinuric rats［J］.JRenin Angiotensin Aldosterone Syst，2003，4（1）：38－42.

［17］ Mandelbaum A，Podjarny E，Bernheim J，et al.Role of thromboxane in the altered vascular reactivity of pregnant rats with adriamycin nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，1999，14（5）：1124－1128.

［18］ Cheng H，F(xiàn)an X，Guan Y，etal.Distinct roles for basal and induced COX-2 in podocyte injury［J］.JAm Soc Nephrol，2009，20（9）：1953－1962.

［19］ Rangan GK，Wang Y，Harris DC.Induction of proteinuric chronic glomerular disease in the rat（Rattus norvegicus）by intracardiac injection of doxorubicin hydrochloride［J］.Contemp Top Lab Anim Sci，2001，40（5）：44－49.

［20］ Porpaczy P，Schmidbauer CP，Georgopoulos A，et al.Concentrations of doxorubicin in renal interstitial fluid after peripheral intravenous and intrarenal artery infusion in dogs［J］.JUrol，1984，131（1）：169－172.

［21］ Johansen PB.Doxorubicin pharmacokinetics after intravenous and intraperitoneal administration in the nude mouse［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1981，5（4）：267－270.

［22］ De Boer E，Navis G，Tiebosch AT，et al.Systemic factors are involved in the pathogenesis of proteinuria-induced glomerulosclerosis in adriamycin nephrotic rats［J］.JAm Soc Nephrol，1999，10（11）：2359－2366.

［23］ Ochodnicky P，Henning RH，Buikema H，et al.Renal endothelial function and blood flow predict the individual susceptibility to adriamycin-induced renal damage［J］.Nephrol Dial Transplant，2009，24（2）：413－420.

［24］ Sakemi T，Ohtsuka N，Tomiyoshi Y，et al.Sex difference in progression of adriamycin-induced nephropathy in rats［J］.Am JNephrol，1996，16（6）：540－547.

［25］ Wang Y，Wang YP，Tay YC，et al.Progressive adriamycin nephropathy in mice：sequence of histologic and immunohistochemical events［J］.Kidney Int，2000，58（4）：1797－1804.

［26］ Zheng Z，Schmidt-Ott KM，Chua S，etal.A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（7）：2502－2507.

［27］ Zheng Z.An ancestralhaplotype defines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the laboratory mouse［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（7）：1796－1800.

［28］ Kastner S，F(xiàn)els LM，Koob-Emunds L，et al.Effects of adriamycin on the balance of glomerular protein metabolism：studies in isolated glomeruli of the atlantic hagfish，myxine glutinosa［J］.Cell Physiol Biochem，1995，5（6）：399－407

［29］ Barbey MM，F(xiàn)els LM，Soose M，et al.Adriamycin affects glomerular renal function：evidence for the involvement of oxygen radicals［J］.Free Radic Res Commun，1989，7（3／6）：195－203.

［30］ Guo J，Ananthakrishnan R，Qu W，et al.RAGEmediates podocyte injury in adriamycin-induced glomerulosclerosis［J］.JAm Soc Nephrol，2008，19（5）：961－972.

R965.1

B

1671－7783（2014）02－0181－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130255

保定市科學研究與發(fā)展計劃資助項目（11ZF009）

2013－11－06 ［編輯］陳海林