CT定量反映非小細胞肺癌組織缺血壞死程度與葡萄糖代謝水平

徐煒，單秀紅，胡慧，諶業(yè)榮，陳建華，丁國文，范鈺，王亞非

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

CT定量反映非小細胞肺癌組織缺血壞死程度與葡萄糖代謝水平

徐煒1，單秀紅1，胡慧1，諶業(yè)榮1，陳建華2，丁國文3，范鈺4，王亞非1

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：評價CT定量反映非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織缺血壞死程度及葡萄糖代謝水平的可行性。方法：選擇52例NSCLC患者，測量患者術(shù)前早期增強CT圖像上病灶的缺血壞死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）；免疫組織化學染色檢測患者術(shù)后肺癌組織標本中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）和碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表達。結(jié)果：52例中，Glut 1表達0級、1級和2級的INCTQ分別為0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差異有統(tǒng)計學意義（F＝10．633，P＝0．000）；Glut1和碳酸酐酶Ⅸ無表達組、單表達組和共表達組的INCTQ分別為0．32±0．25、0．85±0．83和1．37±1．27，差異有統(tǒng)計學意義（F＝4．449，P＝0．017）。結(jié)論：NSCLC早期增強CT能較為準確地評價NSCLC的缺血壞死程度和葡萄糖代謝水平。

非小細胞肺癌；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1；碳酸酐酶Ⅸ；X線計算機體層攝影術(shù)；缺血壞死

腫瘤細胞在惡變過程中最基礎的代謝改變是糖酵解增強［1］。該現(xiàn)象是由于腫瘤生長速度過快，超過了腫瘤血管新生的速度，腫瘤細胞缺氧所致；腫瘤細胞通過缺氧誘導因子（HIF-1）表達增加，一方面促進腫瘤血管生成［2］，另一方面促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter protein 1，Glut1）表達，增加葡萄糖攝取，進行有氧氧化或無氧酵解，既能提供自身所需的ATP，又能利用糖酵解的中間產(chǎn)物進行生物合成［3］。Airley等［4］發(fā)現(xiàn)，在包括非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在內(nèi)的多種腫瘤組織標本中，Glut 1主要在缺血壞死區(qū)周圍高表達，為腫瘤組織壞死標志物。文獻報道，Glut 1在NSCLC組織中陽性表達率達81．4%，其中鱗癌陽性表達率為100%，而且分期越晚，強陽性表達率越高［5］，與預后密切相關(guān)。碳酸酐酶是含鋅金屬酶，具有調(diào)節(jié)體液pH的作用，參與體內(nèi)酸堿平衡調(diào)節(jié)及離子交換等過程。研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶Ⅸ主要在腫瘤壞死區(qū)周圍表達［6］，為腫瘤組織壞死的另一生物標志物。早期增強CT可反映腫瘤的血管生成水平，但作為腫瘤的另一重要特征性表現(xiàn)——腫瘤組織的代謝水平能否被早期增強CT所反映，目前相關(guān)報道不多。CT成像密度分辨率高，根據(jù)其早期增強圖像能夠區(qū)分缺血壞死區(qū)，本研究擬通過早期增強CT對NSCLC病灶的缺血壞死區(qū)進行密度和面積的定量，探討其與缺血壞死生物標志物表達水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 病例

收集江蘇大學附屬人民醫(yī)院2010年12月至2013年5月，術(shù)前經(jīng)本院CT檢查的52例NSCLC病例，年齡39～87歲，平均61．6歲，男36例，女16例。其中，鱗狀細胞癌18例，腺癌31例，腺鱗癌3例。圖像存儲和傳輸系統(tǒng)（PACS）保存有完整的CT圖像資料，病理科有完整的石蠟包埋肺癌組織標本。

1．2 設備、材料及數(shù)據(jù)采集方法

CT系統(tǒng)型號為西門子Sensation 64層CT和PHILIPSBrilliance iCT 256層螺旋極速CT機；碘海醇注射液（碘含量300 mg／mL）為對比劑；兔抗人Glut1多克隆抗體購自美國Bioworld公司，兔抗人碳酸酐酶Ⅸ抗體購自美國芝加哥Proteintech公司，抗體鏈霉抗生物素蛋白、過氧化物酶及二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。病理組織石蠟切片機、切片攤片機、切片烤片機（常州中威電子儀器廠），電熱恒溫水浴箱（美國Pharmacia公司），CX41型光學顯微鏡、PX53型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），病理圖像分析系統(tǒng)（金仕達衛(wèi)寧軟件股份有限公司）。

胸部CT掃描及重建方案：120 kV，120 mAs；胸部平掃，依照1．5 mL／kg的劑量肘靜脈注射碘海醇，速率為3mL／s，延遲35 s全胸部掃描，2次序列容積數(shù)據(jù)采集層厚為0．5 mm或0．625 mm，軸位、冠狀位及矢狀位3 mm層厚縱隔模式重建增強序列的病灶層面。

缺血壞死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）測量：分別顯示增強序列的3 mm層厚的軸位、冠狀位和矢狀位的病灶最大層面，顯示窗位／窗寬為50／250，測量3層面密度明顯較低區(qū)（缺血壞死區(qū)）的面積（SN）和CT值（HN）、其他非缺血壞死區(qū)的面積（SC）和CT值（HC）（圖1），腫瘤病灶INCTQ值按如下公式計算：（HC÷HN）×（SN÷SC）。由3位主治以上影像科醫(yī)師分別獨立測量，取所得數(shù)據(jù)的平均值。

1．3 免疫組織化學試劑及染色計數(shù)方法

采用EnVision兩步法對組織標本進行免疫組織化學染色，簡要步驟如下：肺癌組織石蠟切片3 μm，二甲苯浸泡15 min，梯度乙醇由高到低（無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇）分別浸泡1min，自來水漂洗，H2O2泡10 min，自來水漂洗后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中；4℃過夜，自來水洗，PBS洗，加一抗后4℃孵育12 h；PBS洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS洗，DAB顯色4 s，自來水沖洗，蘇木素復染，自來水洗，1%鹽酸乙醇泡2 s，自來水洗，梯度乙醇由低到高（80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）分別浸泡2 min，切片風干后用中性樹膠封片。

Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表達等級記錄：腫瘤細胞膜呈棕黃色為表達陽性（含或不含胞質(zhì)染色）。Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達及記錄方法：根據(jù)腫瘤細胞陽性表達數(shù)的百分比分為0～2級。在10×10視野下連續(xù)觀察整個切片，腫瘤細胞沒有染色為0級，≤20%為1級，＞20%為2級。

1．4 統(tǒng)計分析

應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析比較不同Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達級別的INCTQ，如方差齊性檢驗顯示方差不齊，則進行對數(shù)矯正，達到方差齊性后再行單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 NSCLC組織中Glut1表達

Glut1陽性表達的腫瘤細胞主要分布在壞死區(qū)周圍和微血管稀少區(qū)，陽性表達率為71．2%（37／52），其中表達0、1和2級分別為15、13和24例。

2．2 NSCLC組織中碳酸酐酶Ⅸ表達

碳酸酐酶Ⅸ陽性表達的腫瘤細胞主要分布在壞死區(qū)周圍，陽性表達率為48．1%（25／52），其中表達0、1和2級分別為27、12和13例。

2．3 INCTQ與Glut1表達的關(guān)系

Glut1表達0級、1級和2級者相應的INCTQ分別為0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差異有統(tǒng)計學意義（F＝10．633，P＝0．000），表明肺癌組織INCTQ越高，Glut1表達水平越高。見圖2。

2．4 INCTQ與碳酸酐酶Ⅸ表達的關(guān)系

52例NSCLC組織中，碳酸酐酶Ⅸ表達0級、1級和2級者相應的INCTQ分別為0．69±0．77、1．10±1．27和1．34±1．18，差異無統(tǒng)計學意義（F＝1．980，P＝0．149），表明肺癌組織INCTQ高低與碳酸酐酶Ⅸ表達水平無明顯相關(guān)性。見圖3。

2．5 INCTQ與Glut1和碳酸酐酶Ⅸ共表達的關(guān)系

52例NSCLC組織中，11例Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達均呈陰性（無表達組），20例Glut1或碳酸酐酶Ⅸ表達呈陽性（單表達組），21例Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表達均呈陽性（共表達組）。3組INCTQ分別為0．32±0．25，0．85±0．83，1．37±1．27（F＝4．449，P＝0．017），說明這兩種壞死標志物不表達時，壞死不明顯；共表達時，壞死程度明顯。見圖3。

3 討論

壞死是惡性腫瘤的特征之一，由于惡性腫瘤生長過快，超過了其新生血管提供營養(yǎng)的范圍，缺血區(qū)發(fā)生缺氧、壞死，如無明顯液化，平掃CT則難以分辨，而早期增強CT圖像則能很好地顯示。因此，本課題組利用延遲35 s的CT增強圖像顯示來測量肺癌病灶的缺血壞死區(qū)。本課題組前期對乳腺癌的INCTQ與壞死標志物的關(guān)系進行探討發(fā)現(xiàn)，CT反映的壞死程度與缺血和壞死標志物的表達有一定聯(lián)系［7］，本研究進一步推廣至NSCLC的研究。

用CT評價肺癌病灶的缺血壞死程度，首先要考慮到缺血壞死區(qū)與非缺血壞死區(qū)的密度差別程度，密度越低，說明缺血壞死越重；其次要考慮到缺血壞死區(qū)的面積，面積越大表明缺血壞死越重。因此，我們應用肺癌病灶的缺血壞死CT定量公式反映病灶內(nèi)缺血壞死區(qū)面積和密度下降程度，較為客觀全面。Ganeshan等［8］用專業(yè)組織質(zhì)地分析軟件檢測平掃NSCLC病灶密度的混雜程度，該混雜程度反映NSCLC病灶的高細胞密度、壞死、出血以及黏液變，研究顯示NSCLC組織高混雜程度與組織內(nèi)Glut1表達密切相關(guān)，即反映了組織葡萄糖代謝水平的高低。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC的INCTQ與Glut 1表達相關(guān)，而與碳酸酐酶Ⅸ表達無明顯相關(guān)；但與Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ共表達的關(guān)系顯示，共表達組INCTQ最高，無表達組最低。由此說明，在肺癌的早期CT增強圖像上測量缺血壞死程度較為準確，并且能反映NSCLC組織葡萄糖代謝水平的高低，對中晚期肺癌而言，可無創(chuàng)地提示個體對放化療的敏感性程度，指導臨床制定合理的綜合治療計劃，提高中晚期肺癌的療效。

［1］ Hsu PP，Sabatini DM．Cancer cell metabolism：Warburg and beyond［J］．Cell，2008，134（5）：703－707．

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［3］ Weljie AM，Jirik FR．Hypoxia-induced metabolic shifts in cancer cells：moving beyond the Warburg effect［J］．Int JBiochem Cell Biol，2011，43（7）：981－989．

［4］ Airley R，Evans A，Mobasheri A，et al．Glucose transporter Glut-1 is detectable in peri-necrotic regions in many human tumor types but not normal tissues：Study using tissue microarrays［J］．Ann Anat，2010，192（3）：133－138．

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［8］ Ganeshan B，Goh V，Mandeville HC，et al．Non-small cell lung cancer：histopathologic correlates for texture parameters at CT［J］．Radiology，2013，266（1）：326－336．

CT quantitative analysis reflects the degree of ischem ic necrosis and the level of glucosemetabolism of non-small cell lung cancer

XUWei1，SHAN Xiu-hong1，HU Hui1，CHEN Ye-rong1，CHEN Jian-hua2，DINGGuo-wen3，F(xiàn)AN Yu4，WANG Ya-fei1
（1．Department of Radiology，2．Department of Pathology，3．Department of Thoracic Surgery，4．Department of Oncology，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To evaluate the feasibility of CT quantitative analysis reflecting the degree of ischemic necrosis and glucosemetabolism level of non-small cell lung cancer（NSCLC）．M ethods：Fifty-two caseswith NSCLC were enrolled in the study，the ischemia necrosis CT quantitative value（INCTQ）for NSCLC tumor on early enhancement CT images before surgery weremeasured．Glucose transporter 1（Glut 1）and carbonic anhydraseⅨ（CAⅨ）protein expression with paraffin embedded specimen after operation were detected by immunohistochemical staining．Results：The INCTQ values of expression of Glut1-negative，grade 1 and grade 2 were 0．35±0．23，0．52±0．55 and 1．55±1．20，respectively（F＝10．633，P＝0．000）；the INCTQ values of the Glut1 and CA IX non-expression group，single expression group and co-expression group were 0．32±0．25，0．85±0．83 and 1．37±1．27，respectively（F＝4．449，P＝0．017）．Conclusion：The early enhancement CT could be used to appraise the ischemia necrosis degree，and reflect the level of glucosemetabolism of NSCLC．

non-small cell lung cancer；glucose transporter protein 1；carbonic anhydraseⅨ；X-ray computed tomography；ischemia necrosis

R977．3

A

1671－7783（2014）06－0470－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140137

徐煒（1982—），男，碩士研究生；單秀紅（通訊作者），副教授，博士，E-mail：13913433095＠163．com

2014－04－13 ［編輯］ 劉星星