微納制造、微流控及生物介觀仿真

陳勇

（江漢大學(xué)交叉學(xué)科研究院，光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江漢大學(xué)），湖北武漢430056）

微納制造、微流控及生物介觀仿真

陳勇

（江漢大學(xué)交叉學(xué)科研究院，光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江漢大學(xué)），湖北武漢430056）

首先解釋了生物介觀仿真的重要性，然后簡(jiǎn)要介紹了生物介觀仿真的兩個(gè)基本方法，即微納制造和微流控技術(shù)，并描述了將這兩種技術(shù)應(yīng)用于生物介觀仿真的幾個(gè)例子。鑒于生命科學(xué)中各學(xué)科領(lǐng)域的飛速發(fā)展，相信發(fā)展以微納制造和微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的介觀仿真工程對(duì)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都會(huì)有很大的推動(dòng)。

微納制造；微流控；生物介觀仿真

0 引言

生物在地球上進(jìn)化，適者生存；細(xì)胞在生物體內(nèi)演變，生老病死；如此，個(gè)體與環(huán)境合二為一，自然而然，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，此乃道。然而，現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)經(jīng)常要將人體細(xì)胞取出研究，并須將其放置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外培養(yǎng)。這無(wú)疑會(huì)使細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境發(fā)生根本的改變；簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞在體內(nèi)所處的環(huán)境是三維的（細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)像）和動(dòng)態(tài)的（可溶因子分布），而被放置于培養(yǎng)皿中的細(xì)胞所處的環(huán)境是二維的（平面培養(yǎng)皿基底）和靜態(tài)的（培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液）。因此很難想象在體外所觀察的細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象能夠很好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的情況。為此，有必要對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)行仿真，包括細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)、細(xì)胞周圍可溶性因子的調(diào)控、細(xì)胞與細(xì)胞相互作用和其他物理量的模擬等，以利更好地研究人體細(xì)胞的行為和演變過(guò)程。這便是生物介觀仿真的主要內(nèi)容和目的。

眾所周知，現(xiàn)代生命科學(xué)對(duì)生物分子、基因、細(xì)胞及組織器官的結(jié)構(gòu)和功能已有了深入的了解，相對(duì)而言，我們對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的認(rèn)識(shí)和仿真還十分有限。近年來(lái)，人們對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell）的各種應(yīng)用寄予了很大的希望，但對(duì)其擴(kuò)增和分化過(guò)程的調(diào)控還不盡人意。這是因?yàn)檎T導(dǎo)多能干細(xì)胞的擴(kuò)增和分化對(duì)細(xì)胞微環(huán)境依賴特別敏感，而已有的細(xì)胞培養(yǎng)體系并不是基于這種細(xì)胞對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的特殊依賴性所建立或發(fā)展的，所以有必要盡快建立以生物介觀仿真為基礎(chǔ)的細(xì)胞微環(huán)境仿真模型，增強(qiáng)其調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)增和分化的能力，從而改進(jìn)相關(guān)的生物醫(yī)療技術(shù)，為細(xì)胞治療、組織工程及再生醫(yī)學(xué)提供更好的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)。

生物介觀仿真是一個(gè)前沿交叉課題，它的基礎(chǔ)是細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)及微納制造和微流控技術(shù)。就微納制造技術(shù)而言，其方法還很少?gòu)纳飸?yīng)用這一角度來(lái)考慮，例如我們到現(xiàn)在還沒(méi)有一種好的方法可用來(lái)對(duì)自然生物材料進(jìn)行圖案化微納結(jié)構(gòu)的制造。就微流控技術(shù)而言，其發(fā)展可謂如火如荼，所涉及的不僅有細(xì)胞和分子生物學(xué)、疾病檢測(cè)和藥物篩選，還包括個(gè)性化治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等，但遺憾的是這方面的應(yīng)用十分有限。筆者認(rèn)為，微納制造及微流控技術(shù)和生命科學(xué)的交叉與融合不僅對(duì)基礎(chǔ)研究具有十分重要的意義，介觀生物仿真還將引領(lǐng)一些新的產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向。本文旨在介紹微納制造和微流控技術(shù)及目前作者實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的幾個(gè)研究課題。

1 微納制造技術(shù)

微納制造的發(fā)展可以追溯到1950年代。當(dāng)時(shí)為制造半導(dǎo)體集成電路的芯片開(kāi)發(fā)了一整套芯片圖形復(fù)制和轉(zhuǎn)移的技術(shù)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)需求的增加，半導(dǎo)體芯片技術(shù)特別是其核心光學(xué)曝光和刻蝕技術(shù)也得到了不斷發(fā)展。目前的半導(dǎo)體集成電路加工工藝以深紫外光光刻（193納米光源）技術(shù)為基礎(chǔ)，雖然它已經(jīng)突破了100納米的極限，但由于材料的限制，進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)將會(huì)有很大的困難。很多年來(lái)，微電子工業(yè)界都在尋求新的納米制造工藝?yán)鐦O限紫外光光刻技術(shù)（13納米光源）來(lái)實(shí)現(xiàn)深納米線寬的集成芯片。除了極限紫外光光刻技術(shù)以外，還有其他新一代納米級(jí)的刻蝕技術(shù)，如X光光刻，電子或離子束投影光刻，微型電子束陣列光刻，等等。這些技術(shù)，都存在相當(dāng)?shù)募夹g(shù)難題，工業(yè)界趨向選擇的極限紫外光光刻技術(shù)，但這種技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用的投資都空前巨大，工藝條件也極其苛刻，不適合用于實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)研究及非半導(dǎo)體器件的生產(chǎn)。

因此，非傳統(tǒng)的微納制造技術(shù)在近些年得到了廣泛的重視和發(fā)展。這些技術(shù)方法簡(jiǎn)單、制作成本低、可應(yīng)用面廣，可以在非極限條件下大面積復(fù)制各種圖案化的納米結(jié)構(gòu)。例如基于模壓技術(shù)的納米壓印技術(shù)（nanoimprint lithography）便是這種非傳統(tǒng)微納制造技術(shù)的典型代表。納米壓印是通過(guò)加溫將模板上的納米圖案復(fù)制到涂在基片上的聚合物薄膜層上，然后再對(duì)其進(jìn)行刻蝕或剝離處理以得到所需的納米結(jié)構(gòu)。這一技術(shù)復(fù)制分辨率和產(chǎn)額高、工藝簡(jiǎn)單而且成本低，因此具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力和廣闊的應(yīng)用前景。其不足之處是需要高溫和高壓，不利于圖形的精確定位與套刻。因此我們?cè)谇靶┠晏岢隽俗贤夤饧{米壓印技術(shù)：先在基片上旋涂一層流動(dòng)性很好的感光聚合物材料，然后用透明的模板壓印并用紫外光照射使感光材料凝固，退模后再用離子反應(yīng)刻蝕或其他方法進(jìn)行圖案轉(zhuǎn)移的后續(xù)加工。因?yàn)椴恍枰邷睾透邏海@一方法的優(yōu)點(diǎn)十分突出。隨后，我們又提出了紫外光軟膜納米壓印技術(shù)，即用軟光刻的方法復(fù)制具有一定彈性和易退模的聚甲基乙氧基硅烷（PDMS）結(jié)構(gòu)作為壓印軟模，只需用很小的壓力就可將這種軟模上的圖案轉(zhuǎn)移到感光聚合物材料的涂層上，經(jīng)紫外光固化和退模后便可得到所需的圖案。與熱壓印相比，這種紫外光軟膜納米壓印技術(shù)可更好地保證大面積納米復(fù)制的均一性。

2 微流控技術(shù)

微流控是一種芯片技術(shù)。用微納制造的方法可以在玻璃、塑料或硅基材料上制作與集成電路類似的微流體芯片，并用它對(duì)微量液體或氣體進(jìn)行精確操作并完成各種化學(xué)和生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。微流芯片基本結(jié)構(gòu)單元的幾何尺寸一般在幾十到幾百微米的范圍之間。

雖然微流芯片可用玻璃和硅等材料制備，但用聚合物材料如塑料和PDMS制作微流芯片具有工藝簡(jiǎn)單、成本低及生物兼容性好的優(yōu)勢(shì)。例如，可以將液態(tài)的PDMS及其催化劑混合物澆鑄在一個(gè)用普通光刻方法制成的光膠模板上，經(jīng)半小時(shí)熱處理PDMS固化，剝離后可打孔，然后經(jīng)等離子表面處理并粘貼在玻璃基片上即得到實(shí)用的微流芯片。在微流芯片的制作過(guò)程中，材料的表面處理具有特別重要的意義。一方面，微流通道的親水性直接影響了微流樣品的輸運(yùn)，通過(guò)物理或化學(xué)的表面改性可以使流體樣品的浸潤(rùn)性得到提高。另一方面，表面處理的好壞，也決定了芯片鍵合及封裝的成功與否。常用的表面處理方法如等離子清洗、化學(xué)清洗和分子自組裝等方法都可以用在微流芯片的加工制作過(guò)程中。

微流芯片可以被看作一個(gè)微量流體的操作和反應(yīng)系統(tǒng)。最簡(jiǎn)單的芯片可由微流通道和與之相連的進(jìn)樣口和出樣口組成。稍微復(fù)雜一點(diǎn)的芯片也可加入微反應(yīng)池、微混合器、微分離單元、微探測(cè)器和其他一些功能單元。功能更強(qiáng)一些的微流芯片有微泵和微閥，以便對(duì)微量流體進(jìn)行有效的操作。但微流芯片中液體的驅(qū)動(dòng)不一定是由機(jī)械泵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，很多其他類型的驅(qū)動(dòng)力諸如壓強(qiáng)（液壓、氣動(dòng)、熱膨脹）、毛細(xì)力、電泳、電滲、介電力、表面聲學(xué)波等都能有效地應(yīng)用于微流液體的驅(qū)動(dòng)。

由于尺寸的減小，微流樣品在芯片中的行為與宏觀影像有著很大的差別。首先，在微流溝道中流體的速度分布是很不均勻的。簡(jiǎn)單的說(shuō)，由于粘滯力的作用，流體在通道中心的流速最大，越靠近管壁，流速越小。微流系統(tǒng)的尺度效應(yīng)也表現(xiàn)在毛細(xì)效應(yīng)、黏彈性、電動(dòng)效應(yīng)等物理過(guò)程中，從而導(dǎo)致一些特異的微流現(xiàn)象。特別重要的是，表面作用將隨著尺度的減小不斷加強(qiáng)，這使得在宏觀流動(dòng)中常被忽略的效應(yīng)如液體的表面張力、粒子電離后產(chǎn)生的庫(kù)侖力、分子極化產(chǎn)生的范德華力、空間位形力等成為必須考慮的因素。如果處理的對(duì)象是比較復(fù)雜的流體，如電解質(zhì)溶液、高分子溶液、有懸浮粒子的液體甚至是凝膠液，多相流體，有化學(xué)反應(yīng)的流體等，問(wèn)題將更復(fù)雜。此時(shí)，應(yīng)當(dāng)用宏觀流體力學(xué)與微觀分子動(dòng)力學(xué)結(jié)合起來(lái)的介觀理論來(lái)表達(dá)特征尺度為微、納米量級(jí)的流動(dòng)問(wèn)題。例如用微流芯片在非溶性的兩相流體中產(chǎn)生穩(wěn)定的液體串并對(duì)其進(jìn)行分裂、聚合等一系列操作。也可在微滴內(nèi)進(jìn)行不同的化學(xué)反應(yīng)，以達(dá)到高通篩選的目的。

3 微納制造、微流控技術(shù)的應(yīng)用

3.1 微納制造技術(shù)的應(yīng)用

微納制造技術(shù)的應(yīng)用極其廣泛。就納米壓印技術(shù)而言，它可以用來(lái)制作納米光學(xué)器件如亞波長(zhǎng)納米光柵、光子晶體、半導(dǎo)體光源及顯示屏的增光膜等，也可用來(lái)制造超高密度磁碟、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、單電子器件等。納米壓印技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用主要包括基因電泳芯片和仿真細(xì)胞外基質(zhì)的制作等。

組織工程和再生醫(yī)學(xué)的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體，由此形成具有生命力的活體組織，對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。例如可用少量的組織細(xì)胞通過(guò)體外擴(kuò)增，進(jìn)行大塊組織缺損的修復(fù)。由于可按組織器官的缺損情況進(jìn)行任意塑形，有望達(dá)到形態(tài)的完美修復(fù)。已經(jīng)證明，體外細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)受基底材料和基底材料表面納米結(jié)構(gòu)的影響。

我們注意到，現(xiàn)有的微納制造工藝主要適用于合成聚合物材料如感光乳膠薄層的圖案化，而理想的細(xì)胞外基質(zhì)材料應(yīng)該是可降解的自然生物材料如膠原蛋白（collagen）等。傳統(tǒng)的微納制造方法顯然對(duì)這類自然生物材料的圖案化不適用。根據(jù)對(duì)生物兼容性和持續(xù)發(fā)展的考慮，我們提出了一個(gè)天然生物材料圖化的新方法：首先通過(guò)負(fù)壓干燥的方法將PDMS的納米圖案復(fù)制在明膠（gelatin）薄層上，然后通過(guò)化學(xué)處理使明膠層的納米結(jié)構(gòu)固定。由此得到的自然生物材料的納米圖案可以用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞的三維支架即細(xì)胞外基質(zhì)介觀生物材料的仿真。

另一個(gè)例子是外周血中稀有細(xì)胞（如循環(huán)腫瘤細(xì)胞）的高效捕獲。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)就有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，但因其數(shù)量非常稀少（每毫升病人樣品或每千萬(wàn)個(gè)血細(xì)胞中不到一個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞），故檢測(cè)具有很大的挑戰(zhàn)性。目前所用的捕獲技術(shù)有兩種：一是根據(jù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特定標(biāo)志物來(lái)修飾磁顆?；蚬腆w的表面，當(dāng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與這些材料的表面發(fā)生免疫作用時(shí)就可被捕獲，其他細(xì)胞則可被清洗掉。二是根據(jù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞的大小或形變能力的不同來(lái)設(shè)計(jì)有一定孔徑的過(guò)濾膜，當(dāng)樣品通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可被捕獲而血細(xì)胞則可通過(guò)。因?yàn)闆](méi)有免疫作用，細(xì)胞不會(huì)受損，所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可用來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)、觀察及藥理實(shí)驗(yàn)等，這種過(guò)濾膜技術(shù)被十分看好。但問(wèn)題是用這種方法所截留的不僅僅是循環(huán)腫瘤細(xì)胞，且還有相當(dāng)數(shù)量的血細(xì)胞，所以選擇性不是太好。最近，我們用微納制造的方法，設(shè)計(jì)并制造了一種特殊的過(guò)濾膜，使其對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的選擇性大大地提高，有望在短期內(nèi)進(jìn)入臨床試驗(yàn)和大規(guī)模應(yīng)用。

3.2 微流控技術(shù)的應(yīng)用

微流控技術(shù)可用于各種生化分析及相關(guān)的物理和化學(xué)實(shí)驗(yàn)。微流控特別適用于細(xì)胞分析、基因測(cè)序、核糖核酸的提取和純化、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。這一技術(shù)還提供了一種單細(xì)胞和分子操控的有效方法。無(wú)論在動(dòng)物或植物體內(nèi)，微流體都在無(wú)時(shí)無(wú)刻地維持或參與著整個(gè)的生命過(guò)程?？梢韵胂?，對(duì)生物體內(nèi)微流體運(yùn)動(dòng)的介觀仿真將推動(dòng)生物醫(yī)療技術(shù)的深入發(fā)展。

從生物工程的角度看，微流控技術(shù)的優(yōu)勢(shì)一目了然。微流控芯片體積小、可集成度高、低成本和可大批量生產(chǎn)，可以在同一個(gè)芯片上集成不同功能的單元，如樣品提取、分子篩選、分離和分析等，從而一次性完成生物實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程。也可以在同一芯片上平行完成需要重復(fù)的分析（如基因解碼、聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)晶等）并通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的系統(tǒng)調(diào)控達(dá)到高通篩選的目的。

顯然，陣列式集成的微流細(xì)胞芯片也有可能大規(guī)模地應(yīng)用于干細(xì)胞分化因子的調(diào)控、生物毒性的檢測(cè)及藥物高通篩選等方面的試驗(yàn)。總之，芯片上的多通道、多功能和多系統(tǒng)的集成（樣品處理、PCR、電泳分離、片上監(jiān)測(cè)自動(dòng)化與計(jì)算機(jī)化）將成為生物芯片技術(shù)總的發(fā)展趨勢(shì)之一。但目前許多功能性單元需要進(jìn)一步研究和優(yōu)化。今后可望在高速基因測(cè)序、基因工程、蛋白質(zhì)學(xué)和細(xì)胞分析等眾多領(lǐng)域得到大規(guī)模的發(fā)展和應(yīng)用。

微流控細(xì)胞分析仍然是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。我們注意到，在此類芯片中細(xì)胞培養(yǎng)大多是灌注的，即細(xì)胞在微流通道或與微流通道緊密相鄰的微池中。由于細(xì)胞表面剪切力的限制，這種方法不利于流體的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。從仿真的角度看，細(xì)胞在體內(nèi)處于毛細(xì)血管之間的狹小空間中，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及信息因子的輸運(yùn)最終是通過(guò)擴(kuò)散來(lái)完成的。因此，要設(shè)計(jì)類似于毛細(xì)血管的微流擴(kuò)散網(wǎng)絡(luò)以進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)和相應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)形成。

微流控技術(shù)與納米壓印技術(shù)有很好的兼容性。將其結(jié)合，我們成功地實(shí)現(xiàn)了基因的快速分離。首先將不同尺寸和不同間距的納米點(diǎn)陣及微流通道分別用納米壓印和光刻技術(shù)復(fù)制到基片上，刻蝕后再將含有微流通道結(jié)構(gòu)的PDMS膜與之封裝。在電場(chǎng)作用下樣品的中的基因片段會(huì)通過(guò)各個(gè)納米點(diǎn)陣。由于大小不同的基因片段受到納米列陣的阻礙是不同的，樣品中的基因片段可以被很快地分離開(kāi)來(lái)。而且納米壓印技術(shù)的低成本，該種納米器件應(yīng)該有一定的商業(yè)化前景。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，微納制造、微流控芯片及介觀仿真在生命科學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。如何抓住這一機(jī)遇，率先建立交叉學(xué)科的優(yōu)勢(shì)和有效的應(yīng)用模式，是當(dāng)前必須考慮和實(shí)踐的重要課題。據(jù)此，筆者在認(rèn)真開(kāi)展各項(xiàng)基礎(chǔ)研究的同時(shí)，開(kāi)發(fā)了一些微納制造和微流控芯片應(yīng)用與生物醫(yī)學(xué)的新設(shè)備和新方法。從所積累的經(jīng)驗(yàn)看，這一模式是可行的，但必須更深層次地參與相關(guān)的醫(yī)療檢測(cè)和臨床應(yīng)用。只有在基礎(chǔ)研究和商業(yè)開(kāi)發(fā)相互協(xié)調(diào)與相互促進(jìn)的條件下，才有希望使微納制造和微流芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得以健康和迅速的發(fā)展。

（References）

［1］CHEN Y，PéPIN A.Emerging Nanolithographic Meth?ods［M］.HOUDY H S P，DUPAS C，LAMANY M. Nanoscience.Berlin：Springer，2007：157-175.

［2］BUGUIN A，CHEN Y，SILBERZAN P.Microfluidics：Concepts and Applications to the Life Sciences［M］//. BOISSEAU P，HOUDY P，LAHMANI M.Nanoscience. Berlin：Springer，2009：743-774.

［3］石劍，陳勇.紫外光軟模納米壓印技術(shù)［G］//.陳勇.前沿科學(xué)的交叉與融合：留法學(xué)人跨學(xué)科研究論文集.北京：北京大學(xué)出版社，2008：30-49.

［4］陳勇.微流芯片技術(shù)與微流芯片實(shí)驗(yàn)室［G］//.陳勇.前沿科學(xué)的交叉與融合：留法學(xué)人跨學(xué)科研究論文集.北京：北京大學(xué)出版社，2008：156-176.

（責(zé)任編輯：葉冰）

Micro and Nanofabrication，Microfluidics and Mesoscopic biomimetics

CHEN Yong
（Key Laboratory of Optoelectronic Chemical Materials and Devices of Ministry of Education，Institute for Interdisciplinary Research，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

We first introduce the concept of mesoscopic biomimetics.Then,we briefly describe the methods of nanofabrication and microfluidics,followed by a few examples of their applications in me?soscopic bioengineering.Taking into account the rapid progress in all areas of life sciences,we be?lieve that this interdisciplinary approach will general great impact for both fundamental and applied researches.

micro and nanofabrication；microfluidics；mesoscopic biomimetics

TH16；TN3

A

1673-0143（2014）03-0005-04

2014-02-27

陳勇（1957—），男，教授，博士生導(dǎo)師，楚天學(xué)者。研究方向：先進(jìn)納米制造、微流控技術(shù)、微納光學(xué)、微納材料、生物檢測(cè)、生物工程及再生醫(yī)學(xué)。