12周下坡跑對去卵巢大鼠股骨骨髓脂肪組織容量和微血管密度的影響

江大雷,劉海濤

12周下坡跑對去卵巢大鼠股骨骨髓脂肪組織容量和微血管密度的影響

江大雷1，2,劉海濤1

目的：探討運(yùn)動對去卵巢大鼠骨髓脂肪組織容量及微血管密度的影響。方法：15只9周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（SHAM）、去卵巢組（OVX）、去卵巢+運(yùn)動組（OVX+EX），每組5只，OVX組和OVX+EX組行去卵巢手術(shù)，SHAM組只切除卵巢周圍少量脂肪組織。OVX+EX大鼠進(jìn)行12周跑臺下坡跑運(yùn)動，跑速為18 m/min，每天運(yùn)動時間為45 min，每周5天。12周后，取右側(cè)股骨進(jìn)行骨密度測定，取左側(cè)股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端制成石蠟標(biāo)本，蘇木素-伊紅染色（HE）用于觀察骨髓病理學(xué)改變，計算骨髓脂肪組織容量百分比，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，CD34抗原標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計算骨髓微血管密度（MVD）。結(jié)果：與SHAM組相比，OVX組大鼠骨密度顯著下降（P<0.05），提示骨質(zhì)疏松造模成功；股骨干骺端骨髓脂肪組織容量百分比顯著增高（P<0.01），骨髓MVD顯著降低（P<0.01）；OVX+EX組大鼠骨密度、骨髓MVD均高于OVX組（P<0.05），骨髓脂肪組織容量百分比顯著低于OVX組（P<0.05）。結(jié)論：12周下坡跑運(yùn)動可以有效抑制大鼠去卵巢后骨密度的下降，降低骨髓脂肪組織容量，提高骨髓微血管密度。

下坡跑；骨質(zhì)疏松；骨髓微血管密度；骨髓脂肪組織

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化增加有關(guān)，表現(xiàn)為骨髓脂肪細(xì)胞增多，造血組織減少，造血組織微血管密度（MVD）降低，且骨密度降低與骨髓脂肪容量增加、微血管密度下降成正相關(guān)[1]。Micro-CT觀察去卵巢小鼠脛骨干骺端血管分布發(fā)現(xiàn)，血管容積、容積分?jǐn)?shù)和平均直徑均顯著降低，局部血液供應(yīng)顯著降低[2]。抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化和改善骨組織局部血供是防治骨質(zhì)疏松可能途徑之一。體外研究表明[3]，力學(xué)刺激抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化和促進(jìn)成骨分化；體內(nèi)研究表明[4-5]，運(yùn)動可以降低骨髓脂肪組織容量，但運(yùn)動是否能夠改善骨質(zhì)疏松骨髓局部血液循環(huán)尚未見報道。本研究通過觀察運(yùn)動對去卵巢大鼠骨髓脂肪組織容量及MVD的影響，初步探討運(yùn)動對骨髓組織成分和血管生成的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物及分組

15只9周齡SD雌性大鼠，SPF級，體重為206.8～221.9g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動物房，環(huán)境溫度為22～24℃，相對濕度為50%～60%，燈光模擬晝夜規(guī)律，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（SHAM）、去卵巢組（OVX）和去卵巢+運(yùn)動組（OVX+EX），每組5只。OVX組和OVX+EX組行去卵巢手術(shù)，而SHAM組只切除卵巢周圍少量脂肪組織，連續(xù)觀察大鼠3天，大鼠傷口愈合情況良好，OVX+EX組開始正式運(yùn)動訓(xùn)練。該實驗設(shè)計通過了北京體育大學(xué)實驗動物倫理委員會的審查。

1.2 去卵巢手術(shù)

采用1%戊巴比妥鈉0.6 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮，在肋骨下約1.5 cm，脊柱旁開1.5 cm處切開皮膚，長度約1 cm，鑷子夾持卵巢組織并提出，輕輕分離卵巢組織周圍脂肪組織，組織鉗夾持卵巢近端紅白交接處。用手術(shù)刀片刮除卵巢組織，可吸收羊腸線結(jié)扎，碘伏涂抹創(chuàng)面，回納組織入腹腔，逐層縫合后，皮膚切口處涂抹紅霉素膏，并將大鼠雙眼涂抹紅霉素眼膏，預(yù)防感染。

1.3 動物訓(xùn)練方法

參考李世昌等[6]的訓(xùn)練方法，OVX+EX組大鼠進(jìn)行跑臺下坡跑運(yùn)動，跑臺坡度為-10°，每次運(yùn)動時先進(jìn)行3 min準(zhǔn)備活動，跑速為10 m/min，之后跑速調(diào)整為18 m/min，每次訓(xùn)練時間為45 min，每周訓(xùn)練5次，共12周。

1.4 取材及處理

12周時，1%戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠后，取右側(cè)股骨用生理鹽水紗布包裹，放入-20°冰箱保存，進(jìn)行骨密度測定。骨密度測定采用雙能X線骨密度儀和小動物用軟件測定股骨遠(yuǎn)端干骺段骨密度。取左側(cè)股骨清理周圍軟組織后，截取遠(yuǎn)側(cè)干骺端部位，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)入4%EDTA溶液脫鈣5周，1%草酸鈉溶液進(jìn)行脫鈣終點(diǎn)檢測表明脫鈣完全，流水沖洗過夜，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作成石蠟標(biāo)本。

1.5 骨髓組織病理學(xué)改變判定

參考浦權(quán)等[7]相關(guān)評定方法，石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度為5 μm，取5張，進(jìn)行HE染色，使用Nikon 50i顯微鏡光鏡下觀察組織病理學(xué)改變，在400×視野下，在目標(biāo)區(qū)域隨機(jī)選取16個視野，并記錄每個視野內(nèi)100個點(diǎn)所對應(yīng)的造血組織、脂肪組織和骨小梁，如交接點(diǎn)對應(yīng)目標(biāo)組織，則計為1點(diǎn)，如擊中邊界處，則計數(shù)為1/2點(diǎn)，共觀察1 600個點(diǎn)。造血或脂肪組織容量百分比為該組織擊中點(diǎn)數(shù)占3種組織擊中點(diǎn)數(shù)之和的比值。

1.6 免疫組化染色及微血管密度（MVD）計算方法

采用CD34抗原作為標(biāo)記抗原進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，2.5%胰酶抗原修復(fù)，3%雙氧水消除過氧化物酶，3%牛血清蛋白（BSA）封閉，加兔源一抗（購于武漢博士德，稀釋濃度為1：100），4°過夜，次日37°復(fù)溫，滴加二抗（購于武漢博士德，SP兩步法超敏抗體試劑盒），室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。陽性切片和陰性切片對照。

微血管組織識別判斷標(biāo)準(zhǔn)為棕黃色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與鄰近血管和骨小梁清楚分開者，不以管腔或管腔中是否有紅細(xì)胞為判斷標(biāo)準(zhǔn),不計入骨小梁內(nèi)或與骨小梁相連的微血管。首先在100×光鏡下選取血管豐富熱點(diǎn)區(qū)域，之后400×光鏡下計數(shù)，計數(shù)5次，計算平均值，計為MVD。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用Mean±SD，采用單因素方差分析比較組間差異，post hoc采用LSD檢驗。組間率的比較采用卡方檢驗，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 大鼠體重變化

第12周時，與SHAM組（294.65±10.64）相比，OVX組（380.65±15.85）大鼠體重顯著增加（P<0.01），OVX+EX組大鼠體重（340.12±12.62）顯著增加（P<0.05），但OVX+EX組大鼠體重顯著低于OVX組（P<0.05）。

2.2 大鼠股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨密度的變化

與SHAM組相比，OVX組大鼠股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨密度顯著降低（P<0.05），而OVX+EX組雖低于SHAM組，但差異不顯著，OVX+EX組大鼠骨密度顯著高于OVX組（P<0.05）（見表1）。

表1 各組大鼠股骨干骺端骨密度（BMD）的比較Table1 Comparison on body mineral density（BMD）of femoral metaphysis among groups.

注：與SHAM組相比，#表示P<0.05；與OVX組相比，*表示P<0.05。

2.3 大鼠股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨髓病理改變

與SHAM組相比，OVX組大鼠股骨干骺段骨髓脂肪組織容量百分比顯著增高（P<0.01），骨髓造血組織容量百分比顯著下降（P<0.01），骨髓MVD顯著降低（P<0.01）。OVX+EX組與SHAM組相比，骨髓脂肪組織容量百分比增加（P<0.05），骨髓造血組織容量百分比減少（P<0.05），骨髓MVD無顯著性差異。而OVX+ EX組大鼠骨髓脂肪組織容量百分比顯著低于OVX組（P<0.05），骨髓MVD顯著高于OVX組（P<0.05）（見表2、圖1、圖2）。

表2 各組大鼠股骨干骺段骨髓病理學(xué)指標(biāo)的比較Table2 Comparison on bone marrow morphology indexes of femoral metaphysis among groups

圖1 各組大鼠股骨干骺段骨髓病理學(xué)變化的比較Figure1 Comparison on bone marrow morphology of femoral metaphysis among groups

圖2 各組大鼠股骨干骺端骨髓微血管密度的比較Figure2 Comparison on bone marrow MVD of femoral metaphysis

3 分析與討論

雙能X線吸收法測定骨密度是判斷骨質(zhì)疏松的首要標(biāo)準(zhǔn)[8]，本研究結(jié)果表明，去卵巢12周后，OVX組大鼠骨密度顯著低于SHAM組，提示骨質(zhì)疏松模型造模成功。而OVX+EX組大鼠進(jìn)行12周的下坡跑運(yùn)動后，其骨密度顯著高于OVX組，這與李世昌等[6]的研究一致，證實了下坡跑運(yùn)動可有效延緩去卵巢大鼠骨密度的迅速下降，具有延緩骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用。

去卵巢后大鼠體重迅速增加，OVX組大鼠體重顯著高于SHAM組，并表現(xiàn)出體態(tài)臃腫、少動、呆滯和抑郁樣表現(xiàn)，與去卵巢后雌激素驟然降低引起體內(nèi)脂類代謝紊亂導(dǎo)致的脂肪堆積有關(guān)[9]。OVX+EX組大鼠體重顯著低于OVX組，可能與運(yùn)動可改善脂肪代謝有關(guān)。王穎捷等[9-10]證實了中等強(qiáng)度運(yùn)動可以改善去卵巢大鼠血脂水平，降低血清TC和LDL/TC比值，降低腹腔內(nèi)脂肪重量，表明運(yùn)動可以改善血脂代謝紊亂狀態(tài)，是防治骨質(zhì)疏松的原理之一。

骨髓切片是評估骨髓組織有核細(xì)胞量或增生程度的金標(biāo)準(zhǔn)[7]，本研究結(jié)果顯示，OVX組大鼠股骨干骺端脂肪組織容量百分比顯著增高?；A(chǔ)研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等，其中脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞是“此消彼長”的關(guān)系[11]，雌激素下降可導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過度分化為脂肪細(xì)胞，則導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量下降，骨髓脂肪組織的增多與成骨能力的降低關(guān)系密切[12]。本研究中，OVX+EX組大鼠骨髓脂肪組織容量百分比明顯低于OVX組，證實了運(yùn)動可以降低骨髓脂肪細(xì)胞容量，這可能與力學(xué)刺激可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化有關(guān)。過氧化物酶體增殖物活化受體家族（PPARs）和骨形成因子（如Runx2）分別是在脂肪分化和成骨分化中主要的轉(zhuǎn)錄因子[13]，體外研究表明，力學(xué)刺激可抑制PPARγ的表達(dá)，促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，從而抑制了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成脂肪分化，誘導(dǎo)成骨分化[14]，但具體機(jī)制方面有待于進(jìn)一步研究[4-5,15]。

骨髓微血管系統(tǒng)由毛細(xì)血管和血竇組成，完成骨髓局部物質(zhì)和氣體交換作用，骨微循環(huán)的變化可影響局部骨細(xì)胞代謝活動。研究結(jié)果表明，12周時，OVX組大鼠骨髓微血管密度非常顯著低于SHAM組，表明去卵巢后骨髓組織局部血供能力明顯下降。這與以下諸多研究一致，BURKHARDT等[16]觀察骨質(zhì)疏松患者活檢標(biāo)本骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，而微血管減少。丁文鴿等[2]通過硅酮橡膠灌注后，顯微CT觀察小鼠脛骨干骺端血管分布情況，結(jié)果表明，去卵巢4周后微血管分布顯著降低，局部血液供應(yīng)減少。楊海濤等[17]采用動態(tài)增強(qiáng)MR觀察去勢兔椎體骨髓血流灌注情況，發(fā)現(xiàn)骨髓MVD顯著降低，血流灌注降低，且兩者顯著相關(guān)，且均與BMD相關(guān)。這些研究表明，血管分布減少和血流灌注降低是骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要原因之一。而本研究中，OVX+EX組大鼠骨髓微血管密度顯著高于OVX組，提示運(yùn)動能夠提高骨髓微血管密度，改善局部血液供應(yīng)，從而實現(xiàn)對骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用?？赡芘c運(yùn)動抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成脂肪分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞生成減少，骨髓脂肪組織容量百分比降低有關(guān)，也可能與力學(xué)刺激促進(jìn)骨髓血管生成作用有關(guān)，確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究確定。后期的研究可采用顯微CT和動態(tài)增強(qiáng)MRI的方法，觀察微血管更多形態(tài)學(xué)指標(biāo)如微血管直徑等指標(biāo)，以及骨髓微循環(huán)血流灌注等的變化，更為詳實地描述運(yùn)動對骨骼局部血液循環(huán)的影響。

4 結(jié)論

（1）大鼠去卵巢12周后，股骨干骺段骨密度降低，骨髓脂肪組織含量顯著升高，骨髓微血管密度顯著下降，局部組織供血能力下降，可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制之一。

（2）12周中等強(qiáng)度下坡跑運(yùn)動可以有效抑制大鼠去卵巢后骨密度的下降，降低骨髓脂肪組織容量，提高骨髓微血管密度，運(yùn)動可通過抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，提高骨組織局部血液供應(yīng)能力，抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)展。

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Effect of 12-Week Downhill running on Femoral Bone Marrow Adipose Tissue Volume and Microvascular DensityinOvariectomizedRats

JIANG Dalei1，2，LIU Haitao1
（1.School of Graduate，Beijing Sports University，Beijing 100084，China;2.Dept.of PE，Xuchang University，Xuchang 461000，China）

Objective:To investigate the effect of exercise on bone marrow adipose tissue volume and microvascular density in ovariectomized rats.Methods:fifteen 9-week-old female SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operation group（SHAM），ovariectomized group（OVX），downhill running group（OVX+EX），5 rats in each group.The rats of OVX group and OVX+EX group underwent ovariectomy，however only a small amount of adipose tissue around the ovary was removed in SHAM group.The rats of OVX+EX group were running downhill on the treadmill for 12 weeks，the running speed was 18m/min for 45 minutes each day，5 days per week.After 12 weeks，bone mineral density（BMD）of the right femur was measured，the left distal femoral metaphysis was made into paraffin specimen which were stained with haematoxylin-eosin（HE）to observe the changes of bone marrow pathology and calculate the percentage of adipose tissue volume.The bone marrow microvascular density（MVD）was examined by means of immunohistochemical staining for CD34 to mark the vascular endothelial cell.Results:Compared with SHAM group，BMDdecreased significantly（P<0.05），which indicated the establishment of osteoporosis model，the percentage of adipose tissue volume increases significantly（P<0.01），and bone marrowMVDdecreased significantly（P<0.01）in OVX group.BMDand bone marrowMVDin the OVX+EX group were higher than that of OVX group（P<0.05），the percentage of adipose tissue volume was lower than that of OVX group（P<0.05）.Conclusions:12-week downhill running can inhibit the decline inBMDin ovariectomized rats，and reduce bone marrow adipose tissue volume and increase bone marrowMVD.

downhill running;osteoporosis;bone marrow microvascular density;bone marrow adipose tissue

G 804.5

A

1005-0000（2014）03-268-04

2014-01-11；

2014-04-27；錄用日期：2014-04-28

河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目（項目編號：12A630130）

江大雷（1981-），男，安徽宿州人，講師，在讀博士研究生，研究方向為運(yùn)動與健康、運(yùn)動損傷的預(yù)防與康復(fù)。

1.北京體育大學(xué)研究生院，北京 100084；2.許昌學(xué)院體育學(xué)院，河南許昌 610041。