水貂綠膿桿菌的分離與鑒定

馬 俊，張 超，曲新澤，樊虓翀，林逢生

（上海啟盛生物科技有限公司，上海 201203）

水貂綠膿桿菌的分離與鑒定

馬 俊，張 超，曲新澤，樊虓翀，林逢生

（上海啟盛生物科技有限公司，上海 201203）

2011～2013年間，從山東省、河北省和江蘇省等地的多個貂場疑似水貂出血性肺炎病貂的肺臟、肝臟和脾臟中分離到425株疑似綠膿桿菌。用綠膿桿菌的OprF和PEA基因的PCR引物對分離菌株的目的基因擴增，經(jīng)核苷酸測序確定其均為綠膿桿菌序列。通過日本生研株式會社血清學(xué)分型系統(tǒng)進行分型：G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。取其中6株細菌（G血清型3株，其他血清型各1株）進行詳細生化試驗，結(jié)果顯示該6株菌均符合綠膿桿菌的生化特性，并且從這6株中選4株細菌（每血清型各1株）腹腔接種小白鼠和氣管內(nèi)接種水貂，結(jié)果表明4株菌對其均有致病性。

出血性肺炎；綠膿桿菌；血清型；分離與鑒定

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）或稱銅綠假單胞菌是引起水貂出血性肺炎的病原體。水貂出血性肺炎是一種以出血性肺炎和敗血癥為主要特征的急性傳染病，發(fā)病急，死亡快，常呈地方性季節(jié)性暴發(fā)流行，發(fā)病貂場死亡率在10%～50%[1]，給養(yǎng)貂業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。1953年Knox等[2]在丹麥首次報道了水貂出血性肺炎。該病在瑞典、芬蘭、美國、法國、日本等國均有報道。1984年，中國潘鐮生[3]首次報道了該病，此后陸續(xù)有發(fā)生[4-6]，近幾年來根據(jù)有關(guān)報道[7-8]和我們的現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果表明，該病在各養(yǎng)貂省如山東省、吉林省、黑龍江省、河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)古相繼頻繁暴發(fā)。2011年9月，威海市榮成地區(qū)某貂場養(yǎng)殖1萬只水貂，發(fā)生水貂出血性肺炎，共死亡1600 多只，病死率達到16%。2012年8月，濰坊諸城市某貂場養(yǎng)殖量為6000只，8月份時出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、死前口鼻出血等呼吸道癥狀，持續(xù)死亡達十多天，每天死亡10多只，高峰期可達60只，死亡率達22%，造成嚴重的經(jīng)濟損失。2012 年10月，文登市宋村鎮(zhèn)某水貂養(yǎng)殖場發(fā)生水貂出血性肺炎，死亡率高達35%。引起水貂出血性肺炎的綠膿桿菌血清型很多，不同血清型之間幾乎沒有交叉免疫保護，并且對抗生素的耐藥性強，給水貂出血性肺炎的防治工作帶來很多的困難。

本實驗室在2011～2013年間，從山東省、河北省和江蘇省等地的病貂肺臟、肝臟、脾臟中分離了425株綠膿桿菌，進行了分子生物學(xué)和生化特性鑒定、血清學(xué)分型及動物感染試驗的系統(tǒng)研究，并且首次在國內(nèi)分離到水貂綠膿桿菌E血清型菌株，為我國水貂出血性肺炎防治研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與實驗動物病料采集自山東省即墨市、海陽市、榮成市、文登市、諸城市、河北省昌黎縣、唐山市樂亭縣和江蘇省連云港市等地的貂場；PCR所用陽性對照雞綠膿桿菌菌株為揚州大學(xué)傳染病實驗室饋贈；微量生化反應(yīng)鑒定管（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）；綠膿桿菌血清分型用標準陽性血清（日本生研株式會社）；溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、牛肉浸出粉3 g、溴化十六烷基三甲胺0.3 g、瓊脂14 g，調(diào)整pH為7.5，121 ℃滅菌20 min；ICR小鼠：SPF級、雌性、體重約20 g、約5周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；水貂：健康黑色標準貂、雌性、年齡約4個月齡，購自上海市南匯區(qū)某貂場。

1.2 細菌分離打開患疑似出血性肺炎病貂的胸腔和腹腔，無菌采集肺臟、肝臟、脾臟病料接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，對生長的疑似菌落連續(xù)傳代進行革蘭氏染色及形態(tài)觀察。

1.3 分子生物學(xué)鑒定綠膿桿菌的外毒素A（PEA）是重要的致病因子；外膜蛋白F（OprF）是綠膿桿菌的最重要外膜蛋白之一，抗F蛋白抗體對綠膿桿菌具有高度的特異性，與免疫保護有關(guān)[9-14]。所以我們根據(jù)GenBank提交的序列（GenBank登錄號: NC_002516.2）設(shè)計了針對PEA和OprF的兩對引物以對分離的細菌進行PCR擴增。煮沸法制備細菌PCR模板，利用PCR擴增綠膿桿菌的PEA基因和OprF基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

擴增PCR程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物加在含有5 μg/mL EB的1%瓊脂糖凝膠中，以標準100 bp DNA Marker作為參考，100 V電泳40 min，在凝膠成像儀上觀察。有特異性條帶，切膠，按照DNA純化試劑盒說明書進行膠回收，送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 用于擴增OprF和PEA基因的引物序列Table 1 Sequences of the primers used to amply OprF and PEA genes

1.4 血清學(xué)鑒定用玻板凝集試驗進行血清型分型。按日本生研株式會社的綠膿桿菌血清學(xué)分型試劑盒操作說明進行操作：將待檢測菌株單菌落接種于溴化十六烷基三甲胺液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心重懸后取一滴與30 μL分型血清進行混合，同時設(shè)抗原與生理鹽水反應(yīng)作為陰性對照組。充分混合后，1 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.5 生物學(xué)特性經(jīng)過血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后，從中挑取6株待檢菌株（M02、M06和MJM1株為G型，M03株為B型，M12株為C型，M13株為E型）單菌落，接種生化反應(yīng)管進行生化項目測定，生化反應(yīng)條件按說明書進行。

1.6 致病性試驗G、B、C、E四種血清型各挑選一株（MJM1、M03、M12和M13株）進行動物致病性試驗。

1.6.1 小鼠致病性試驗 取25只小鼠，隨機分為5組，每組5只，第1～4組為攻毒組。上述4種血清型菌株的16 h培養(yǎng)液進行10倍稀釋后，分別腹腔接種第1～4組小鼠，0.5 mL/只，同時進行活菌計數(shù)；第5組為對照組，腹腔接種細菌培養(yǎng)基，0.5 mL/只。攻毒后連續(xù)觀察5日，記錄小鼠的臨床癥狀和死亡情況。

1.6.2 水貂致病性試驗 上述4種血清型菌株在37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，原液做10倍系列稀釋作為水貂接種物，并進行活菌計數(shù)。取82只約4月齡健康母貂，隨機分為17組，其中第1～16組，每組5只，剩余1組（第17組）2只作為對照。每株菌接種4組水貂，分別氣管內(nèi)接種100、10-1、10-2、10-3的稀釋菌液，0.5 mL/只；對照組，氣管內(nèi)接種細菌培養(yǎng)基，0.5 mL/只。攻毒后連續(xù)觀察5日，記錄水貂的臨床癥狀和死亡情況，用Reed- Muench法計算每種菌對水貂的LD50。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離和培養(yǎng)特性將貂場采集的病料劃線接種于選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。若在培養(yǎng)基上菌落呈微隆起或扁平狀向周邊擴散或略有蔓延，表面光滑濕潤，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性綠色或褐色色素，經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈兩端鈍圓的桿菌，單個或成雙排列的分離菌，初步判定為綠膿桿菌，共425株。普通平板上菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果分別見圖1和圖2。

圖1 綠膿桿菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Pseudomonas aeruginosa

圖2 綠膿桿菌革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of Pseudomonas aeruginosa

2.2 分子生物學(xué)鑒定分離的425株菌，OprF引物擴增的目的條帶大小約為1400 bp，PEA引物擴增的目的條帶大小約1600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，M03（B血清型）、M06（G血清型）、M12（C血清型）和M13（E血清型）的PCR結(jié)果見圖3。PCR片段經(jīng)序列分析比對，結(jié)果表明以上2.1初步判定為綠膿桿菌的425株確實為綠膿桿菌菌株。

圖3 4種血清型綠膿桿菌PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplif cations of Pseudomonas aeruginosa of 4 serotypes

2.3 血清學(xué)鑒定依照日本生研說明書進行試驗，若待檢菌液與特異血清反應(yīng)出現(xiàn)凝集塊，且生理鹽水空白對照不凝集者為陽性，沒有凝集則為陰性。結(jié)果顯示所分離的425株綠膿桿菌均能與G型或B型或C型或E型抗血清發(fā)生凝集，其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。從分離到不同血清型菌株的臨床病料來源看，E型、C型菌株均與G型或B型菌株混合感染。

2.4 生化特性選取的6株細菌生化試驗結(jié)果見表2，生化試驗結(jié)果均符合綠膿桿菌的生化特性。

表2 選取的6株綠膿桿菌生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical test results of 6 pseudomonas aeruginosa isolates selected

2.5 致病性試驗

2.5.1 小鼠的致病性 所有接種綠膿桿菌的小鼠在攻毒后24 h內(nèi)死亡，死亡率達100%，而對照組5只小鼠均健活，活菌計數(shù)得出各血清型綠膿桿菌菌株小鼠的攻毒劑量。MJM1（G型）：1.2×108cfu；M03（B型）：1.0×108cfu；M12（C型）：1.3×108cfu； M13（E型）：1.5×108cfu。

2.5.2 水貂的致病性 水貂氣管內(nèi)接種這4株菌后，發(fā)生了不同程度的死亡，而對照組水貂均健活，詳細情況見表3。用Reed-Muench方法計算MJM1、M03、M12和M13株綠膿桿菌的LD50分別為7.6×106、1.6×107、5.2×106和2.0×107cfu。

表3 4株綠膿桿菌對水貂的致病性和LD50測定Table 3 The pathogenicity of the 4 pseudomonas aeruginosa isolates in minks and determination of LD50

3 討論

本實驗室采用綠膿桿菌選擇培養(yǎng)基，從多個水貂養(yǎng)殖場爆發(fā)疑似水貂出血性肺炎的水貂內(nèi)臟中分離細菌。根據(jù)菌落形態(tài)、所產(chǎn)的色素、革蘭氏染色、OprF基因和PEA基因PCR擴增及序列測定對比，確定425株分離菌為綠膿桿菌。在此基礎(chǔ)上，采用日本生研株氏會社的血清分型系統(tǒng)對這425株細菌進行了分型。其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%；水貂綠膿桿菌E血清型首次在我國報道。2011年白雪等[7]首次對分離的45株水貂綠膿桿菌進行血清型分型（日本生研分型系統(tǒng)）：G 型42株（占93.4%）、B型2株（占4.4%）和I型1株（占2.2%），并報道，近10年來特產(chǎn)所從全國各地收集的67株水貂綠膿桿菌主要為G、B和C型，但沒有提到具體的百分數(shù)，與歐洲和美國報道的主要流行血清型基本相同[1,7,8]。各報道中每個血清型的比例存在一定的差距，如Hammer等[1]報道在丹麥從1998至2001年期間74個水貂場發(fā)生的出血性肺炎病料中，分離到的168株綠膿桿菌中，G型117株，占69.6%；B型21株，占12.5%；C型30株，占17.8%。本實驗室分離出的C型和E型菌株均是從G型或B型菌株感染的病例中分離到的，是混合感染，并且在同一臨床樣品中，G型或B型菌株是占絕對多數(shù)；并且，從菌落形態(tài)、所產(chǎn)的色素、革蘭氏染色結(jié)果很難區(qū)分不同的血清型菌株，這可能導(dǎo)致C型、E型菌株分離率較低。

根據(jù)發(fā)表的文獻報道，水貂綠膿桿菌同一血清型的不同菌株或同一菌株對水貂和小鼠的致病性有所不同。本試驗選取的4株（G、B、C和E血清型各1株）對小鼠和水貂均有致病性，并且通過水貂氣管內(nèi)接種各血清型菌株，得出各血清型菌株對水貂半數(shù)致死量（LD50）沒有很大的差別（少于5倍量），說明各血清型的綠膿桿菌均存在對水貂毒力強的菌株。

近年來，水貂出血性肺炎發(fā)生頻率逐年上升，已成為水貂養(yǎng)殖業(yè)的大病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。同時，水貂出血性肺炎臨床流行現(xiàn)狀也出現(xiàn)了新趨勢，發(fā)病區(qū)域由沿海地區(qū)向內(nèi)地蔓延，以前集中在大連市、山東省沿海等地，近來在河北、吉林省等內(nèi)陸地區(qū)發(fā)病日益增多；發(fā)病高峰期變長，以往集中在8、9月份，現(xiàn)在6月初即有綠膿桿菌導(dǎo)致的出血性肺炎發(fā)生，7～10月都是該病發(fā)病高峰期。已有的文獻報道和我們的試驗結(jié)果（沒有發(fā)表）表明G、B、C和E血清型之間沒有交叉保護或交叉保護力很低，故疫苗包含的血清型最好能涵蓋所有流行血清型，國外這4個血清型的多價苗在市場上已應(yīng)用多年，國內(nèi)研發(fā)出能夠保護所有流行血清型的多價疫苗是目前預(yù)防該病的一個重要研究方向。綠膿桿菌引起的出血性肺炎發(fā)病急、死亡迅速，發(fā)現(xiàn)發(fā)病時往往來不及投藥治療，所以采取預(yù)防加治療的方式，可以有效的減少發(fā)病概率和經(jīng)濟損失。由于在臨床生產(chǎn)中抗生素的不合理使用，綠膿桿菌已對大部分抗生素產(chǎn)生了耐藥性，故一旦發(fā)現(xiàn)疫情后，需充分利用臨床診斷和實驗室檢驗，通過藥敏試驗選擇合理的敏感抗生素進行交叉投喂，并大群緊急接種多價疫苗，可有效的控制病情，減少損失。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PSEUDOMONAS AEROGINOSA OF MINKS

MA Jun, ZHANG Chao, QU Xin-ze, FAN Xiao-chong, LIN Feng-sheng
(Shanghai Qisheng Biotechnology Co. Ltd, Shanghai 201203, China)

Total 425 isolates of suspectedPseudomonas aeroginosawere isolated from 2011 to 2013 from lungs, spleens and livers collected during breakouts of hemorrhagic pneumonia on mink farms in Shandong, Hebei and Jiangsu provinces. Two pairs of PCR primers were designed based on sequences of OprF and PEA genes, respectively. The DNA templates were extracted from these 425 isolates and amplif ed in PCR using the primer sets. The sizes of PCR products and nucleotide sequences conf rmed that all 425 isolates were minkPseudomonas aeroginosa. Serological typing divided these isolates into 4 serotypes: 376 (88.5%) isolates in G serotype, 34 isolates (8.0%) in B serotype, 12 isolates (2.8%) in C serotype and 3 isolates (0.7%) in E serotype. Six isolates (3 from G serotype and one from each of other 3 serotypes) were randomly selected for further biochemical tests. All of these 6 isolates met requirements forPseudomonas aeroginosa. In addition, 4 out of these 6 isolates (one serotype each) were inoculated into mice and minks and caused all animals sick.

Hemorrhagic pneumonia;Pseudomonas aeroginosa; serotype; isolation and identif cation

S852.614

A

1674-6422（2014）01-0044-06

2013-11-17

馬俊，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

林逢生，E-mail：linfengsheng@bioqy.com