高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因缺失標(biāo)記疫苗ELISA鑒別診斷方法的建立

孫 晶，周艷君，姜一峰，徐彥召，童 武，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因缺失標(biāo)記疫苗ELISA鑒別診斷方法的建立

孫 晶，周艷君，姜一峰，徐彥召，童 武，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了配合（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）基因標(biāo)記疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株）的臨床抗體鑒別診斷應(yīng)用，本研究以標(biāo)記疫苗中缺失的25個(gè)氨基酸多肽作為包被抗原，通過對ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定抗原最適包被濃度為500 ng/孔，血清最佳稀釋度為1:40，同時(shí)確定其陰陽性臨界值S/P判定標(biāo)準(zhǔn)為0.15，批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其變異系數(shù)均低于10%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。對臨床血清檢測結(jié)果顯示與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果的符合率為94.84%，采用25 aa負(fù)標(biāo)記ELISA方法檢測HuN4-F112免疫豬血清，結(jié)果顯示從免疫后21 d可檢測25 aa特異性抗體，該抗體至少可持續(xù)存在126 d。本研究建立的ELISA檢測方法為今后PRRSV基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株在臨床鑒別診斷的應(yīng)用提供了有利保障。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；多肽抗原；25aa-ELISA

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病[1]。1987年首先在美國發(fā)現(xiàn)該病，以各年齡段母豬繁殖障礙和呼吸疾病為特征的傳染性疾病在美國和加拿大地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并迅速向世界各地蔓延[2]；1996年我國學(xué)者郭寶清等[3]首次分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV），2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRS）的爆發(fā)[4,5]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失，PRRS的監(jiān)測和防控成為重要課題。

目前，豬繁殖與呼吸綜合征流行毒株包括PRRS經(jīng)典毒株、PRRS經(jīng)典疫苗株、PRRS高致病性毒株、PRRS高致病性疫苗株等，對該病毒監(jiān)測存在很大難度[6]。該病的流行特點(diǎn)及其病原特性決定其高度傳染性，使用疫苗是目前預(yù)防本病的最主要手段。國內(nèi)的疫苗主要包括弱毒疫苗和滅活疫苗，弱毒疫苗具有抗體產(chǎn)生快、持續(xù)時(shí)間長和保護(hù)力強(qiáng)等特點(diǎn)，在臨床上被廣泛使用于控制PRRS的流行，但傳統(tǒng)的弱毒疫苗在抗體監(jiān)測過程中無法區(qū)分野毒和疫苗毒感染。

基于此，本實(shí)驗(yàn)室在P R R S V弱毒疫苗HuN4-F112株反向遺傳平臺(tái)的基礎(chǔ)上，將NSP2的復(fù)制非必須區(qū)域（Δ508-532）進(jìn)行缺失，同時(shí)在該區(qū)域插入新城疫病毒NP蛋白末端49個(gè)氨基酸（NP49）作為標(biāo)記，成功構(gòu)建了雙標(biāo)記基因工程弱毒疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株）[7,8]。該疫苗株由于具備缺失和插入正、負(fù)雙標(biāo)記，這就為特異性區(qū)分野毒感染和實(shí)現(xiàn)PRRS有效防控奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在研究中為了有效監(jiān)測基因工程標(biāo)記疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株）的抗體水平，與其他自然感染野毒和疫苗毒進(jìn)行鑒別和區(qū)分，我們針對基因工程標(biāo)記疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株）的特征缺失的25個(gè)氨基酸（25 aa）作為包被抗原，建立一種特異性25aa-ELISA檢測方法，從基因工程標(biāo)記疫苗的負(fù)標(biāo)記角度達(dá)到鑒別診斷目的。

1 材料與方法

1.1 血清和試劑PRRSV陰性血清、PRRSV HuN4-F112陽性血清、PRRSV rHN4-Δ25+NP49株陽性血清、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV）陽性血清、豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）陽性血清和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）陽性血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存；豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus, PPV）陽性血清、豬圓環(huán)2型病毒（Porcine circovirus-2, PCV-2）陽性血清為哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室提供；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗豬IgG購自Sigma公司；脫脂乳購于BD公司；TMB顯色液、脫脂乳、牛血清蛋白（BSA）購自AMRESCO公司；PRRSV抗體檢測試劑盒HerdCheck PRRS X3購自IDEXX公司。

1.2 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定將特異性缺失區(qū)域25 aa多肽抗原用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋成10倍梯度進(jìn)行包被（10 μg/mL至0.125 μg/mL），每孔包被100 μL，4 ℃包被過夜后，5 %脫脂乳于37 ℃封閉2 h。PRRSV HuN4-F112株陽性血清、陰性血清分別1:20、1:40、1:80、1:160稀釋，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h進(jìn)行ELISA方陣試驗(yàn)。HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG抗體1:10 000倍稀釋，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。加入100 μL TMD顯色底物，室溫避光顯色10 min。50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測定各孔OD450值，確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋濃度。

1.3 最佳反應(yīng)條件的確定從包被時(shí)間、封閉液的選擇、封閉時(shí)間、血清稀釋液、酶標(biāo)二抗稀釋度、底物反應(yīng)時(shí)間等方面進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，其他條件不變，對HuN4-F112株陽性血清和陰性血清進(jìn)行25aa-ELISA測定，經(jīng)酶標(biāo)儀測OD450值，比較各組陰、陽性血清的OD450值和P/N值，確定最佳反應(yīng)條件。

1.4 臨界值的確定收集300份臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)血清，依照已經(jīng)優(yōu)化條件25aa-ELISA方法，測定OD450值，計(jì)算血清樣品的S/P值。通過SPSS（statistical product and service solutions）軟件繪制ROC曲線，得出25aa-ELISA檢測方法的靈敏度（sensitivity）和特異度（specificity）。數(shù)據(jù)處理分析，得出S/P值的陰陽性血清臨界值（cut off value）。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)以建立的25aa-ELISA方法，檢測已知的CSFV、PRV、PPV、PEDV、PRRS rHN4-Δ25+NP49株陽性血清，同時(shí)設(shè)立PRRSV HuN4-F112株陽性血清和陰性血清對照，確定25 aa多肽抗原與其他常見豬病的交叉反應(yīng)性。

1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)選取6份PRRS HuN4-F112抗體水平不同的豬血清，在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測，每份血清平行做3個(gè)重復(fù)，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；批間重復(fù)試驗(yàn)選取上述血清，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，使用3個(gè)不同時(shí)間包被的ELISA檢測板進(jìn)行檢測，每份血清平行做2個(gè)重復(fù)，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 臨床血清符合性實(shí)驗(yàn)對310份臨床血清樣品，分別采用間接25aa-ELISA方法和IDEXX的豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒（IDEXX Herd Check? PRRS X3）同時(shí)進(jìn)行檢測，比較兩種檢測方法的結(jié)果，計(jì)算兩者之間的符合率。同時(shí)對5頭免疫PRRS HuN4-F112不同時(shí)間采集的試驗(yàn)豬血清用25aa-ELISA方法對其進(jìn)行檢測，通過1.4方法確定的臨界值判定方法，分析臨床血清中特異性抗體產(chǎn)生和持續(xù)存在的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定抗原的初始濃度為1 mg/mL，通過棋盤法檢測結(jié)果顯示隨著抗原和抗體稀釋倍數(shù)的增加，陽性血清的OD值存在下降趨勢，陰性血清的OD值變化不顯著。選擇陰性血清的OD450值≤0.100，陽性血清的OD450值≥0.200，陽性血清和陰性血清OD450比值P/N≥2的最大稀釋度，即血清的稀釋度為1:40，抗原的稀釋濃度為1:200，確定每孔抗原包被量為500 ng為最佳（見表1）。

表1 棋盤法測定陽性血清和陰性血清的OD450值Table 1 The optimization of coating concentration with virus by checkerboard titration

2.2 最佳反應(yīng)條件的確定通過25aa-ELISA各反應(yīng)條件的摸索與優(yōu)化，最終確定4℃過夜為抗原最佳包被條件；封閉液為5%脫脂乳，4℃過夜封閉；2%BSA為血清稀釋液，作用時(shí)間為30 min，二抗稀釋度為1:8000，作用時(shí)間為30 min，TMB底物作用時(shí)間為20 min（如圖1A、B、C、D、E、F）。

2.3 臨界值判定檢測臨床血清樣品300份，同時(shí)設(shè)IDEXX檢測結(jié)果對照，陰性血清為148份，陽性血清為152份。根據(jù)檢測結(jié)果繪制ROC曲線，其中靈敏度為縱坐標(biāo)，以 1-特異性為橫坐標(biāo)。ROC 曲線下面積為0.984（95 % CI :0. 974～0.994）。

ROC分析列出從-0.124到5.915連續(xù)193個(gè)切點(diǎn)對應(yīng)的靈敏度和1-特異度，對各切點(diǎn)靈敏度和特異度求和，得到的數(shù)值最大值為1.880，對應(yīng)的S/P值為0.154，此值為陰陽性臨界值，其靈敏度為93.4%、特異度為94.6% 。

2.4 特異性試驗(yàn)對已知CSFV、PRV、PPV、PEDV、PRRS rHN4-Δ25+NP49陽性血清檢測結(jié)果顯示OD450值分別為0.087、0.075、0.099、0.073、0.078，表明25 aa多肽抗原與上述豬病陽性血清沒有交叉反應(yīng)。

圖1 25aa-ELISA反應(yīng)條件Fig.1 Optimization of 25aa-ELISA reaction conditions

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)選取6份PRRS HuN4-F112抗體水平不同的豬血清，在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV%）均小于10 %（見表2）。

2.6 樣品的符合率檢測應(yīng)用間接25aa-ELISA方法與IDEXX公司生產(chǎn)的PRRSV抗體檢測試劑盒HerdCheck PRRS X3檢測樣品，對310份血清樣品進(jìn)行判定并分析。結(jié)果如表3所示，表中*代表兩種檢測方法結(jié)果一致的樣品，兩者的陽性符合率為95.00%，陰性符合率為94.67%，總符合率達(dá)到94.84%。

使用25aa-ELISA方法對臨床背景已知的HuN4 F112血清進(jìn)行檢測，通過OD值進(jìn)行S/P值判定，結(jié)果顯示豬免疫后21 d開始出現(xiàn)25 aa抗體陽性，此后一直持續(xù)檢測到126 d仍呈現(xiàn)25 aa抗體陽性（圖2）。

表2 25aa-ELISA 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Intro-batch and inter-batch duplicability test of 25aa-ELISA

表3 血清樣品的IDEXX Herd Check PRRS X3與25aa-ELISA檢測結(jié)果比較Table 3 The comparison of serum detection by IDEXX HerdCheck PRRS X3 and 25aa-ELISA

圖2 25aa-ELISA檢測HuN4-F112血清樣品結(jié)果Fig. 2 The results of 25aa-ELISA testing HuN4-F112 serum samples

3 討論

免疫預(yù)防是控制PRRS的重要手段，但是諸多不同種類弱毒疫苗株的普遍應(yīng)用，也為對PRRSV野毒感染的鑒別診斷帶來了困難。本研究室選擇NDV NP49基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)域作為標(biāo)記基因，利用反向遺傳操作技術(shù)缺失了PRRSV NSP2基因中的25 aa區(qū)域，構(gòu)建了基因標(biāo)記弱毒疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株），并通過免疫效果評價(jià)證實(shí)該疫苗株具有較好的免疫保護(hù)效果[7,8]?；谠摶驑?biāo)記疫苗株自身存在25 aa缺失的特點(diǎn)，可以使我們利用其建立區(qū)分其他毒株感染和弱毒疫苗免疫的鑒別診斷方法，從而更有助于對PRRS疫情的有效控制。

ELISA檢測方法已經(jīng)被普遍應(yīng)用于對PRRS血清抗體檢測，該方法可以短時(shí)間內(nèi)檢測大量血清樣本，具有良好的特異性和靈敏度[9]。ELISA檢測方法中包被抗原按照來源可以分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。本試驗(yàn)中我們采用特異性標(biāo)記區(qū)域缺失的25個(gè)氨基酸（25 aa）多肽作為抗原，保證抗原的特異性和純度，避免了其他雜蛋白混雜存在干擾，而且25 aa相對分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，降低了與其他病毒細(xì)菌抗體交叉反應(yīng)的可能性。該合成肽抗原呈水溶性，可較好的包被于酶標(biāo)板，操作省時(shí)方便。特異性多肽抗原不同于PRRSV全病毒抗原或高表達(dá)量的融合蛋白抗原，由于PRRSV感染豬產(chǎn)生的抗體大部分是針對N蛋白，血清樣品中針對25 aa多肽抗原的抗體相對較少，因此選擇純度高的25 aa多肽作為包被抗原可以明顯提高針對25 aa抗體檢測的敏感度和特異性[10-12]。同時(shí)在洗滌過程中，通過增大25aa-ELISA的洗滌液鹽離子濃度，還可以有效去除非特異性影響。本研究中使用PBST需要40 min才能有效去除非特異性，當(dāng)增大鹽離子濃度后，洗滌時(shí)間可縮短至15 min。

ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)[13]。本實(shí)驗(yàn)采用靈敏度和特異度之和最大值為最佳陽性臨界值[14]。根據(jù)PASS軟件的ROC分析，S/P臨界值為0.15。在ROC曲線上最靠近坐標(biāo)圖左上方的點(diǎn)為靈敏度和特異度均較高的陽性臨界值，本試驗(yàn)中25aa-ELISA檢測方法的敏感性為93.4%和特異性為94.6%。利用本方法檢測已知背景的HuN4-F112株免疫血清樣品，可判定為針對25aa血清轉(zhuǎn)陽時(shí)間為21 d，利用IDEXX試劑盒檢測N蛋白血清轉(zhuǎn)陽時(shí)間為14 d。表明在PRRSV感染或免疫后針對Nsp2蛋白中25 aa肽段的抗體產(chǎn)生相對于N蛋白的抗體明顯滯后，因此在早期檢測25aa抗體呈現(xiàn)陰性。對臨床樣品檢測結(jié)果顯示，證明該方法具有良好的特異性和重復(fù)性，上述試驗(yàn)表明通過本研究建立的25aa-ELISA檢測方法，能夠有效區(qū)分PRRS野毒感染和基因標(biāo)記疫苗免疫豬的血清抗體，為今后PRRSV基因工程標(biāo)記疫苗的應(yīng)用提供了有效檢測方法。

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DEVELOPMENT OF ELISA DIFFERENTIATION DIAGNOSIS FOR A DUALMARKER VACCINE OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS

SUN Jing, ZHOU Yan-jun, JIANG Yi-feng, XU Yan-zhao, TONG Wu, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS, Shanghai 200241,China)

To develop a ELISA method for detection of antibody against 25aa in Nsp2 region which was deleted from a dual-marker PRRSV vaccine strain rHN4-Δ25 + NP49. The 25aa peptide was synthesized artif cially and used as antigen to coat the microplate for ELISA. The optimal coating concentration of antigen was 500 ng/well. optimal serum dilution was 1:40, and the cut off S/P value was 0.15. The reproducibility test showed that the coeff cients of variation for intra- and inter-assay were lower than 10%. 25aa-ELISA method was used to test clinical samples and compared with commercial PRRSV-detection-kit (IDEXX). The results showed that coincidence of two methods was 94.84%. Then 25aa-ELISA was used to test HuN4-F112 immunized serum samples from 1 to 126 days post immunization (dpi). Specific antibody against 25aa was detected during 21 to 126 dpi. The vaccine immunized pigs could be differentiated from naturally infected pigs with wild type PRRSVs. Therefore, this study set up a foundation for further investigation of the differentiation diagnosis for a dual-marker vaccine rHN4-Δ25 + NP49.

Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; peptide antigen; 25aa-ELISA

S852.659.6

A

1674-6422（2014）01-0030-07

2013-10-09

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A208-2)；國家國際科技合作重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目(2010DF33920)；科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(xiàng)資金(2012EG134237)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2012)第2-5號)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)預(yù)算增量項(xiàng)目(2013BL039)

孫晶，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn