雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架對小型豬冠狀動脈內(nèi)膜增生及細(xì)胞分裂周期基因2、基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)的影響

胡德喜，陸東風(fēng)，林剛毅

(1.湖南益陽市中心醫(yī)院急診科，413000;2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;3.廣東汕頭市中心醫(yī)院老干科)

當(dāng)前，臨床廣泛應(yīng)用的藥物洗脫支架主要是雷帕霉素洗脫支架(SES)和紫杉醇藥物洗脫支架(PES)，探索一種既能有效降低再狹窄又能減少血栓形成的新型藥物支架是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本課題組從1999年開始對雷公藤內(nèi)酯醇的作用機(jī)制進(jìn)行研究，希望發(fā)揮我國中醫(yī)藥的優(yōu)勢，研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)藥物洗脫支架，使更多的患者獲益。本實(shí)驗(yàn)探討雷公藤內(nèi)酯醇藥物洗脫支架抑制再狹窄的機(jī)制，為雷公藤內(nèi)酯醇藥物洗脫支架的進(jìn)一步研制和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小型豬冠狀動脈標(biāo)本制備 18只健康國內(nèi)西藏小型豬(動物合格證號:DB31/T240-2001)，雄性，4～6月齡，體質(zhì)量20～25 kg，隨機(jī)分3組，分別為不銹鋼裸支架組、雷帕霉素洗脫支架組、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組。每只豬選擇左前降支和右冠脈分別置入同一類型支架各1枚(型號均為2.5 mm×23 mm大小)，共置入支架36枚。設(shè)立7 d和28 d兩個觀察點(diǎn)，7 d觀察點(diǎn)每組各2只豬，28 d觀察點(diǎn)每組各4只豬。術(shù)后7 d和28 d復(fù)查冠狀動脈造影后放血處死動物，取出心臟，4%中性緩沖甲醛70 mm Hg加壓灌注固定30 min后分離冠狀動脈支架血管段，0.9%氯化鈉注射溶液沖洗。

1.2 定量評價(jià)支架血管段組織損傷及內(nèi)膜增生

1.2.1 取材部位 用剪刀垂直于管腔，剪取支架血管段的近、中和遠(yuǎn)端三個部分為病理組織標(biāo)本，各段標(biāo)本長度約2 mm，4%中性緩沖甲醛固定。

1.2.2 切片和染色 帶金屬支架標(biāo)本硬塑料包埋后，用骨科切片機(jī)切片，切片厚度5 μm，每段血管切1片，每支架共3片，所有切片用HE染色制備光鏡標(biāo)本。每個支架段血管的參數(shù)都取每個支架近、中和遠(yuǎn)三段血管3個切片測量值的平均值。

1.2.3 微圖像分析 應(yīng)用Carl Zeiss顯微鏡和AxioVision圖像處理系統(tǒng)測定冠狀動脈外彈力膜層橫斷面積、支架上平均內(nèi)膜厚度、支架間平均內(nèi)膜厚度，觀察血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的移行、增殖及內(nèi)膜厚度變化，拍照以作記錄。按Gunn等［1］報(bào)道的方法計(jì)算血管損傷積分，評估三組的血管損傷程度。評分方法如下:0分，內(nèi)彈力膜完好未受壓;1分，內(nèi)彈力膜受壓，變形＜45°;2分，內(nèi)彈力膜受壓，變形＞45°;3分，內(nèi)彈力膜受壓撕裂;4分，外彈力膜受壓撕裂。每個血管截面的損傷積分為五個金屬柱桿積分的平均值。

1.3 免疫組織化學(xué)染色觀察基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、細(xì)胞分裂周期基因2(CDC2)的蛋白表達(dá)水平

1.3.1 取材部位 取硬組織切片后剩余的支架血管段組織在解剖顯微鏡下，用眼科鑷子小心抽去血管中的支架，盡量完整保留血管壁結(jié)構(gòu)。然后將血管段石蠟包埋，制備蠟塊備用。

1.3.2 病理切片的制備 取已制備好的血管段石蠟包埋塊作3 μm厚的連續(xù)切片，45℃水浴中展開，粘附在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，分別做好標(biāo)記，室溫下自然風(fēng)干。

1.4 結(jié)果判定 MMP-2和CDC2免疫組織化學(xué)分析陽性表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒樣沉淀。用Image Pro Plus 5.0圖像軟件系統(tǒng)分析，選取固定大小研究區(qū)域測量平均灰度值，并且每次測量平均灰度值時以同一血管周圍的背景作為對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以觀察表達(dá)的蛋白含量。其原理是在同一光照強(qiáng)度下，陽性區(qū)域強(qiáng)弱不同表達(dá)為所吸收或透過光的數(shù)值是不同的，由此顯示出灰度的差異。測量目標(biāo)顏色越深，透過的光線越少，灰度值越小，顏色越淺，透過的光線越多，灰度值越大。因此，灰度參數(shù)可相對定量反映陽性強(qiáng)弱的變化，可用于衡量組織或細(xì)胞中某種成分的含量［2］。根據(jù)此原理，在光強(qiáng)度及曝光時間相同的條件下，每例切片在10×40光學(xué)顯微鏡下任選5個視野，測定其陽性顆粒的平均灰度值，以此代表冠狀動脈組織中MMP-2和CDC2的蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析處理，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 冠狀動脈支架段血管平均損傷積分和血管內(nèi)膜增生情況 見表1。

支架植入后7 d，各組動脈內(nèi)膜支架撐桿周圍可見呈不連續(xù)線性排列的紅染物質(zhì)。裸支架組可見增生內(nèi)膜幾乎全部包繞支架撐桿，雷帕霉素洗脫支架組、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組支架撐桿兩側(cè)可見內(nèi)膜增生，管腔面支架裸露。各組支架上內(nèi)膜厚度、支架間內(nèi)膜厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

支架植入后28 d各組紅染物質(zhì)進(jìn)一步增加，呈連續(xù)線性排列，血管內(nèi)膜完全內(nèi)皮化。裸支架組支架上內(nèi)膜厚度、支架間內(nèi)膜膜厚度較雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。支架間內(nèi)膜厚度兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雷帕霉素組和雷公藤內(nèi)酯醇100 μg組相似(P=0.259)，見表 1。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測

2.2.1 MMP-2表達(dá)情況 支架植入后7 d，MMP-2在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒樣沉淀。MMP-2在動脈壁組織表達(dá)的平均灰度值裸支架組(7.02±2.92)、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架 100 μg組(30.56 ±4.62)、雷帕霉素洗脫支架組(32.34±4.76)，表達(dá)的平均灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。裸支架組中強(qiáng)表達(dá)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)，各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P=0.495)。

支架植入后28 d，平均灰度值裸支架組(11.66±3.33)、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架 100 μg 組(21.19 ±1.22)、雷帕霉素洗脫支架組(21.46 ±2.66)，各組MMP-2表達(dá)的平均灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。MMP-2在裸支架組陽性強(qiáng)表達(dá)，在雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)，兩兩比較和7d組相似。

2.2.2 CDC2表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)分析示支架植入后7 d，CDC2激酶在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒樣沉淀。CDC2激酶在動脈壁組織表達(dá)的平均灰度值裸支架組(13.31±1.91)、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100μg組(26.81 ±6.66)、雷帕霉素洗脫支架組(25.46±3.64)，各組CDC2表達(dá)的平均灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P=0.596)。裸支架組中強(qiáng)表達(dá)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)。

表1 各組病理組織學(xué)檢測結(jié)果(±s)

表1 各組病理組織學(xué)檢測結(jié)果(±s)

注:7 d觀察點(diǎn)每組各2只豬，28 d觀察點(diǎn)每組各4只豬

組別 外彈力膜面積(mm2)損傷積分(分)7 d支架上內(nèi)膜厚度(μm)7 d支架間內(nèi)膜厚度(μm)28 d支架上內(nèi)膜厚度(μm)28 d支架間內(nèi)膜厚度(μm)裸支架組 6.54 ±0.29 2.24 ±0.21 11.09 ±0.23 21.23 ±2.15 180.38 ±9.23 195.53 ±12.25雷帕霉素組 6.77 ±0.32 2.20 ±0.25 0 5.11 ±1.24 80.77 ±8.30 111.51 ±11.25雷公藤內(nèi)酯醇100 μg 組 6.57 ±0.35 2.18 ±0.22 0 5.13 ±1.40 97.72 ±7.51 114.76 ±9.42 t值0.221 0.124 0.547 3.215 8.413 13.404 P值0.457 0.302 0.035 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

支架植入后28 d，CDC2激酶在動脈壁中膜SMC和內(nèi)膜胞漿中都有表達(dá)。CDC2在小型豬冠狀動脈壁組織表達(dá)的平均灰度值裸支架組(8.24±5.38)、雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架 100 μg 組(16.51 ±3.57)、雷帕霉素洗脫支架組(18.40 ±2.26)，各組CDC2表達(dá)的平均灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P＞0.05)。CDC2激酶在裸支架組中強(qiáng)表達(dá)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架 100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)。

3 討論

支架術(shù)后再狹窄的機(jī)制主要包括:血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與增生;血管內(nèi)膜平滑肌(VSMC)的過度增殖與遷移;血栓形成;細(xì)胞外基質(zhì)的作用;炎性反應(yīng)和血管重塑［3］。作為免疫抑制藥物，雷公藤內(nèi)酯醇可應(yīng)用于許多自身免疫性疾病的治療。由于它的生理活性強(qiáng)，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、及免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。本次研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，在各組血管損傷程度基本相同的情況下，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組和雷帕霉素洗脫支架組抑制內(nèi)膜增生程度相當(dāng)，與裸支架比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg組劑量能很好的抑制血管內(nèi)膜過度增生，預(yù)防再狹窄。

MMPs是參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白酶家族［4］。血管平滑肌細(xì)胞增殖及從中膜向內(nèi)膜的遷移是動脈再狹窄發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而由VSMC產(chǎn)生的MMPs對細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)SMC的遷移。周曉莉等［5］發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈球囊損傷1 d后MMP-2的表達(dá)升高，7 d后達(dá)高峰，14 d后逐漸下降。本研究通過免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)MMP-2染色陽性的是動脈中膜的SMC，意味著動脈組織中MMP-2由SMC產(chǎn)生。支架植入后7 d和28 d，MMP-2在裸支架組中強(qiáng)表達(dá)，雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。支架置入后，SMC增殖及從中膜向內(nèi)膜的遷移是動脈再狹窄發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而由SMC產(chǎn)生的MMPs對細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)了SMC的遷移。雷公藤內(nèi)酯醇100 μg能抑制MMP-2的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制SMC的遷移增殖，減少新生內(nèi)膜形成，為預(yù)防管腔狹窄的重要機(jī)制之一。

CDC2激酶是細(xì)胞分裂周期(CDC)基因2編碼的相對分子質(zhì)量為34×103的蛋白質(zhì)，屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，它只有與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故又稱細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)［6］。我們通過免疫組織化學(xué)分析顯示支架植入后7 d CDC2激酶在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達(dá)，28 d時在動脈壁中膜SMC和內(nèi)膜胞漿中都有表達(dá)。7 d和28 d時，裸支架組CDC2激酶強(qiáng)表達(dá);雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達(dá)。本研究結(jié)果提示雷公藤內(nèi)酯醇100 μg洗脫支架與雷帕霉素洗脫支架對CDC2表達(dá)的影響相同，使CDC2基因轉(zhuǎn)錄受抑所導(dǎo)致的活性化CDC2蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞G2/M周期停滯，這可能為雷公藤內(nèi)酯醇洗脫支架抑制SMC的增殖和新生內(nèi)膜形成，預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的又一重要機(jī)制。

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