血管緊張素II通過下調血管外膜過氧化氫酶促進血管重塑的研究

沈凱 袁國裕 陳士良

血管緊張素II通過下調血管外膜過氧化氫酶促進血管重塑的研究

沈凱 袁國裕 陳士良

目的 探討血管緊張素II（AngiotensinII，AngII）是否通過調控血管外膜過氧化氫酶（Catalase，CAT）促進血管重塑。方法 培養(yǎng)大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞，分為對照組、AngII組、PD98059（ERK1/2抑制劑）組、AngII+PD98059組，取4～7代用于實驗；使用含107mol/L Ang II的DMEM培養(yǎng)液分別刺激成纖維細胞0、0．5、2、6、12、24h，研究Ang II對CAT作用的時間關系；分別以0、108、107、106、105mol/L的AngII刺激成纖維細胞24h，研究Ang II對CAT作用的濃度關系；采用PD98059(ERK1/2抑制劑)，研究ERK1/2信號通路對CAT表達的影響。 結果 AngII能夠顯著下調CAT的表達，并呈時間和劑量依賴性；AngII能夠通過ERK1/2信號通路下調血管外膜CAT的表達，阻斷ERK1/2信號通路能夠恢復CAT的表達。 結論 AngII可能通過ERK1/2信號通路下調血管外膜CAT的表達，進而促進血管重塑的發(fā)生，導致血管病理性重塑發(fā)生。

血管緊張素II過氧化氫酶 血管重塑

血管重塑是高血壓病的一種顯著性病理特征，與高血壓形成互為因果。既往關于血管重塑的研究主要集中于血管內膜的內皮細胞和中膜的血管平滑肌細胞，忽略了血管外膜改變在血管重塑中的作用[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下血管外膜可產生大量活性氧（ROS），通過自分泌、旁分泌作用參與血管重塑發(fā)生[2]。過氧化氫酶（CAT）是一種重要的抗氧化酶，其在清除ROS特別是H2O2時發(fā)揮著重要的作用，可以保護機體避免氧化應激造成的損傷。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是引起高血壓性血管重塑的重要介質，但抗氧化酶CAT在AngⅡ誘導的高血壓性血管重塑尤其是在血管外膜中的變化及所發(fā)揮的作用不甚清楚。本研究擬通過對AngⅡ孵育時間、劑量以及對ERK1/2信號通路的調控作用，研究其對血管外膜CAT表達的影響，以期為高血壓血管重塑的防治提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及材料 清潔級雄性SD大鼠體重150～180g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。試驗材料包括AngⅡ（美國Sigma公司），組織蛋白抽提液（美國Pierce公司），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺（美國Fluka公司），PVDF膜（美國Millipore公司），DMEM高糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素鈉、鏈霉素（上海先鋒藥業(yè)公司），α-SM-Actin一抗（美國Sigma公司），Tripsin（美國Sigma公司），BCA蛋白濃度測定液（武漢碧云天公司），磷酸化ERK1/2多克隆抗體（美國CST公司），ERK1/2抑制劑PD98059（武漢碧云天公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國HERA cell公司），普通相差顯微鏡（德國Zeiss公司），PAGE凝膠電泳及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 雄性SD大鼠處死后，常規(guī)消毒，剖胸取出胸主動脈，放入盛有DMEM的培養(yǎng)皿中。仔細分離血管周圍結締組織，DMEM洗2遍，縱向剖開血管。在另一培養(yǎng)皿中放少量培養(yǎng)液，將血管鋪平，輕輕刮下內膜，仔細分離中膜、外膜。在另一培養(yǎng)皿中滴加一滴胎牛血清，放入新鮮分離的外膜，將其剪成大約1mm3大小的組織塊。添加含有 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5～7 d后細胞 80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。取4～7代用于實驗。

1.2.2 AngⅡ孵育時間對CAT表達的測定 將4～7代的血管外膜成纖維細胞接種于60mm的培養(yǎng)皿中，待長至亞融合狀態(tài)，以無血清培養(yǎng)液靜止細胞24h后，分別給予以下處理：AngⅡ時相組含107mol/L AngⅡ的DMEM培養(yǎng)液分別刺激成纖維細胞0、0.5、2、6、12、24h。

1.2.3 AngⅡ孵育濃度對CAT表達的測定 將4～7代的血管外膜成纖維細胞接種于60mm的培養(yǎng)皿中，待長至亞融合狀態(tài)，以無血清培養(yǎng)液靜止細胞24h后，分別給予以下處理：AngⅡ劑量組分別以0、108、107、106、105mol/L的AngⅡ刺激成纖維細胞24h。

1.2.4 AngⅡ對ERK1/2通路影響的測定 AngⅡ+ ERK1/2抑制劑PD98059：在培養(yǎng)液中加入105mol/L PD98059孵育半小時后，再加入AngⅡ（107）刺激24h。AngⅡ+PEG-CAT：在培養(yǎng)液中加入1 000U/LPEG-CAT孵育半小時后，再加入AngⅡ（107）刺激24h。

1.2.5 免疫印跡法檢測蛋白表達水平 培養(yǎng)的血管外膜成纖維細胞按上述分組后干預24h，提取細胞總蛋白后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗（CAT：1∶1 000；β-actin：1∶5 000）4°孵育過夜，第2天復溫后加HRP標記的二抗孵育1h，之后用ECL發(fā)光液顯影。利用Gelpro32軟件進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同孵育時間、濃度對CAT表達的影響 見圖1～3。由圖1～3可見，AngⅡ能夠顯著下調CAT的表達，并且呈時間、劑量依賴性。同時，AngⅡ能夠促進外膜成纖維細胞α-actin的表達，表達外膜成纖維細胞在向肌成纖維細胞轉化，而給予PEG-CAT后，能夠阻斷AngⅡ誘導的α-actin表達。

2.2 AngⅡ通過ERK1/2對CAT、α-actin表達的影響見圖4～6。

圖1 AngⅡ孵育時間對CAT表達的影響（與0h比較，**P＜0.01）

圖4 AngⅡ刺激ERK1/2磷酸化（與對照組比較，**P＜0.01）

圖5 AngⅡ通過ERK1/2調控CAT表達（與AngⅡ比較，*P＜0.05）

圖6 AngⅡ通過ERK1/2調控α-actin表達（與AngⅡ比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

在AngⅡ下調CAT表達的同時，能夠誘導ERK1/2磷酸化（圖4），給予ERK1/2信號抑制劑PD98059后，CAT蛋白表達顯著恢復（圖5），同時α-actin的表達降低（圖6），AngⅡ通過ERK1/2信號通路下調抗氧化酶CAT的表達，進而促進成纖維細胞的表型轉化。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，AngⅡ孵育能夠顯著下調抗氧化酶CAT的表達，同時我們給予ERK1/2信號通路抑制劑后能夠阻斷AngⅡ誘導的CAT下調及外膜成纖維細胞的表型轉化，提示AngⅡ是通過ERK1/2信號通路介導調控CAT的表達變化，與Han[3]的研究結果一致。我們的研究證實了AngⅡ可能通過調控氧化/抗氧化系統(tǒng)使其失衡來促進血管重塑的發(fā)生。

以前觀點認為血管外膜只是起輔助支撐作用，但越來越多的研究證明血管外膜在各種血管重塑過程中發(fā)揮著重要作用：Herrmann等[4]發(fā)現(xiàn)在高血壓早期，血管外膜的重構過程要早于中膜和內膜。亦有學者提出從外膜開始的炎癥反應學說[5]：認為血管損傷后其炎癥反應始于外膜。血管外膜受到損傷等因素刺激時能夠釋放多種血管活性物質（IL-6、MCP-1等）刺激細胞增殖、遷移等病理變化[6]。另外，外膜成纖維細胞還可以產生細胞外基質如膠原、彈性蛋白參與血管的損傷反應，從而影響血管的結構和功能[7]。外膜成纖維細胞也是產生ROS主要位點之一[8]。ROS是AngⅡ等各種要素引起血管病變的重要病理生理機制。過多的ROS產生自分泌和旁分泌作用，包括刺激細胞分化、生長、肥厚，以及使內皮依賴性舒張因子失活，使內皮依賴性舒張作用受損[9]。

既往諸多研究證實了血管外膜成纖維細胞是ROS的重要來源，其ROS的產生依賴于NADPH氧化酶[10]。但既往研究主要從ROS的產生及氧化酶方面對AngⅡ等誘導的血管重塑進行探討。少有研究從機體抗氧化系統(tǒng)的角度進行研究，我們的研究證實了在給予CAT干預后，能夠有效減弱AngⅡ誘導的外膜成纖維細胞的表型轉化，這提示恢復抗氧化系統(tǒng)的表達能夠顯著改善AngⅡ誘導的高血壓性血管重塑。

本實驗發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠顯著下調CAT的表達，并且呈時間、劑量依賴性。同時，AngⅡ能夠促進外膜成纖維細胞α-actin的表達，表達外膜成纖維細胞在向肌成纖維細胞轉化，而給予PEG-CAT后，能夠阻斷AngⅡ誘導的α-actin表達。這表明恢復CAT的表達能夠顯著抑制AngⅡ誘導的外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，亦即可阻斷AngⅡ誘導的血管重塑的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激在下調CAT表達的同時，能夠誘導ERK1/2磷酸化，給予ERK1/2信號抑制劑PD98059后，CAT蛋白表達顯著恢復，同時α-actin的表達降低，這進一步表明，AngⅡ可能通過ERK1/2信號通路下調抗氧化酶CAT的表達，進而促進成纖維細胞的表型轉化。我們的研究證實CAT參與了AngⅡ誘導的血管重塑過程，AngⅡ導致的氧化/抗氧化體系的失衡是導致血管重塑的重要原因。為高血壓及其并發(fā)癥的防治提供了新的理論思路和潛在的治療靶點。

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AngiotensinⅡ promotes vascular remodeling by down-regulation of adventitia catalase

ObjectiveTo investigate the effect of ANGⅡon vascular remodeling and its relation to regulation of adventitia catalase．Methods Adventitia fibroblasts were collected from rat thoracic aorta．The cultured adventitia fibroblasts were treated with ANGⅡ,PD 98059(ERK1/2 inhibitor)or ANGⅡwith PD98059,respectively．Fibroblasts were treated with 107mol/L ANGⅡfor 0,0．5,2,6 and 24h;or with 0,108,107,106,105mol/L ANGⅡfor 24h．The catalase(CAT)contents in culture supernatants were measured．Results ANGⅡ remarkably decreased CAT contents in a time-dose dependent manner．Blockage of ERK1/2 signal pathway by PD98059 increased the expression of CAT in adventitial fibroblasts．Conclusion ANGⅡcan down-regulate the adventitia CAT through ERK1/2 signal pathway,which leads to the vascular remodeling．

ANGⅡ Hydrogen peroxide Vascular rebuilt

2013-08-29）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（2011KYA170）

316000 舟山醫(yī)院心內科