梨白蘭地中乙醇碳同位素分布特征研究

程 濤，鐘其頂 *，王道兵，武竹英，李國輝，王 敏

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.全國食品發(fā)酵工業(yè)標準化中心，北京 100015）

白蘭地生產(chǎn)在我國歷史悠久，然而直至中國第一個民族葡萄酒企業(yè)—張裕葡萄釀酒公司成立后，國內(nèi)白蘭地才真正得以發(fā)展。改革開放以后，我國的白蘭地工業(yè)和國外交流頻繁，較好的實現(xiàn)了與國際接軌，特別是近幾年來，隨著人們生活水平的提高，白蘭地逐漸被人們所喜愛[1-2]。目前，國產(chǎn)白蘭地的年產(chǎn)量為2 000萬L左右，大量白蘭地產(chǎn)品需從國外進口，其中僅干邑白蘭地的銷售總量就超過了2 700萬L（2012年數(shù)據(jù)），天然白蘭地的工藝復雜，釀造成本較高，因而價格也較高，也正因為此，國內(nèi)白蘭地市場比較混亂。據(jù)調(diào)查，市場的假洋白蘭地的比例不斷上升，另有一些不法商家為節(jié)約成本，摻入廉價的糖與果汁進行發(fā)酵，或者直接采用食用酒精進行勾兌以冒充天然白蘭地。

根據(jù)GB/T 17204—2008《飲料酒分類》的定義，白蘭地是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、調(diào)配而成的蒸餾酒。但諸如摻入廉價糖或果汁進行發(fā)酵，或以食用酒精等食品添加劑進行生產(chǎn)的假冒偽劣產(chǎn)品，其理化指標可能與正規(guī)的白蘭地產(chǎn)品相近或相同，因此當前廣泛使用的理化分析法難以對其進行區(qū)分和辨別[3-5]。

穩(wěn)定同位素技術在食品摻假鑒別中具有重要作用，現(xiàn)在已成功用于果汁摻水[6-7]、摻糖分析[8-9]、蜂蜜摻糖[10-11]、谷物和水果酒精的質量評價[12-14]及植物學來源[15-19]等多個方面。ROBMANN A等[20]分別應用該技術甄別葡萄酒、龍舌蘭酒和白蘭地[21]真假，鐘其頂?shù)萚22]研究了穩(wěn)定碳同位素技術在固態(tài)法白酒和固液法白酒鑒別中的應用，效果良好。然而，國內(nèi)還未有白蘭地領域的相關應用，尤其缺乏穩(wěn)定同位素分布特征及影響因素的研究。本研究以梨白蘭地為研究對象，調(diào)查了其乙醇碳同位素分布特征，分析了其主要的影響因素，探討了應用氣相色譜-燃燒-同位素比值質譜儀（gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry，GC-C-IRMS）辨別白蘭地產(chǎn)品真假的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨汁樣品：選取新鮮、飽滿、無病斑、無劃痕的果實，去除果梗、果核和果皮，切成瓣狀放入攪拌機中攪拌5 min，2 000 r/min 離心10 min取上清液，冷藏待用；梨果：2013年4月至2014年9月購自北京某農(nóng)貿(mào)市場和家樂福超市；梨原白蘭地：北京某梨白蘭地廠；安琪活性干酵母；去離子水；氫氧化鈣粉末；0.1 mol/L硫酸溶液；氦氣（純度≥99.999%）；丙酮（色譜純）：韓國DUKSAN Pure Chemicals有限公司。除特殊注明外，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Delta V advantage 氣相色譜-燃燒-同位素比值質譜儀（配Triplus自動進樣器）、安捷倫DB-Wax毛細管色譜柱（50 m×0.32 mm×0.20 μm）；FLASH 2000元素分析-同位素比值質譜儀（element analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）：美國Thermo fisher公司；3K15離心機：美國Sigma公司；LGJ-JA-80冷凍干燥機：北京亞泰科隆儀器技術有限公司；ZH7924電熱恒溫水浴箱：北京中慧天城科技有限公司；HDM-1000磁力攪拌器：北京世紀華科實驗儀器有限公司；XS205U十萬分之一天平：瑞士Mettler-Toedo公司；LRH系列恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；1500夏朗德壺式蒸餾器：新鄉(xiāng)市圣達輕工機械有限公司；JE25C11榨汁機：美的集團。

1.3 方法

1.3.1 糖的分離提取

取40 mL果汁于50 mL離心管中，在相對離心力（relative centrifugal force，RCF）1 400×g條件下離心10 min，然后將上清液轉移至100 mL小燒杯中，加入1.6 g氫氧化鈣粉末，攪拌均勻后于90 ℃水浴中靜置3 min；將上述熱溶液轉移至50 mL離心管中，在RCF為1 400×g條件下離心3 min，棄去沉淀，取上清液，用0.1 mol/L的硫酸調(diào)整其pH 值為5.0左右；將上述酸化后的上清液置于4 ℃冰箱靜置約15 h，去除沉淀，將溶液冷凍干燥并均質成粉末。

1.3.2 發(fā)酵處理

取果汁100 g，高壓蒸汽滅菌后加入1.0 g安琪釀酒活性干酵母，無氧條件下在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵至質量恒定。

1.3.3 乙醇的處理

乙醇經(jīng)過丙酮稀釋后由自動進樣器進樣，進入燃燒管充分燃燒成CO2，再由載氣帶入IRMS中測定其δ13C值。

1.3.4 測定條件

GC-C-IRMS色譜程序：載氣為氦氣；柱流速1.0 mL/min；進樣口溫度200 ℃；升溫程序為：起始溫度40 ℃，保持5 min，以1 ℃/min 升溫至50 ℃后保持1 min后以15 ℃/min 升溫至200 ℃并保持2 min；進樣體積1 μL；分流比20∶1。

EA-IRMS工作條件：氧化管溫度980 ℃，還原管溫度680 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min[25]。

1.3.5 糖的測定

稱取約0.1 mg粉末于錫杯中，包好后待測，每個樣品平行測定2次，得出樣品的δ13C值。

1.3.6 乙醇的測定

發(fā)酵液經(jīng)丙酮稀釋后直接進樣測定，每個樣品測定兩次。

1.3.7 結果表示

實際工作中采用相對測量法，將待測樣品的碳同位素比值與碳同位素國際標準美國南卡羅來納州白堊紀皮狄組層位中的擬箭石化石（peedee belemnite，PDB）同位素比值比較，以千分差（‰）的形式表示樣品的同位素組成，記作δ13C。δ13C的計算公式如下：

Rsample和Rstandard分別表示樣品和國際標準品的同位素（13C/12C）比率。

2 結果與分析

2.1 乙醇δ13C值分布特征

選取北京、新疆、河北等地區(qū)的梨，榨汁后發(fā)酵，GCC-IRMS測定乙醇δ13C值，結果見表1所示。

表1 不同地區(qū)水果發(fā)酵后乙醇δ13C值Table 1 Ethanol δ13C of fruit in different regions after fermentation

表1數(shù)據(jù)表明，梨汁發(fā)酵乙醇的δ13C值分布范圍為-29‰～-27‰，符合C3植物發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇的碳同位素特征；但是，盡管同是梨汁發(fā)酵，同一產(chǎn)地不同品種的梨汁發(fā)酵乙醇δ13C值很接近，而不同產(chǎn)地的梨汁乙醇δ13C值差異卻比較大。為研究該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，測定了各梨汁的總糖中δ13C，以梨汁總糖的δ13C值（x）為橫坐標，發(fā)酵后乙醇的δ13C值（y）為縱坐標，繪制其相關性曲線，結果見圖1。

圖1 酵前總糖和乙醇的δ13C值之間的相關性Fig.1 Correlation of δ13C values between sugar content and ethanol before fermentation

由圖1可知，盡管總糖與乙醇的δ13C值之間存在一定差異（-29.01‰～-25.31‰），但二者相關性良好（R2=0.98），這與ROBMANN A等從葡萄汁與葡萄汁發(fā)酵液中得到的結果一致；雖然決定植物有機物δ13C值分布特征的是植物的光合作用類型[27]，但同種植物，由于各自生長環(huán)境中的溫度、濕度、光照條件、大氣壓力、鹽分和營養(yǎng)元素含量的差異，均會影響植物穩(wěn)定同位素的分餾過程乃至植物穩(wěn)定同位素組成，而發(fā)酵過程中糖的同位素組成差異則顯現(xiàn)在其代謝產(chǎn)物乙醇中。

2.2 白蘭地蒸餾過程的影響

自然界存在著廣泛的穩(wěn)定同位素分餾作用，若轉化/收集不完全，由于不同穩(wěn)定同位素構成的分子的質量差異，穩(wěn)定同位素含量易出現(xiàn)變化。白蘭地是一種高雅香醇的飲料酒，它的芳香物質主要是通過蒸餾獲得的，為研究該工序對乙醇δ13C值的影響，在蒸酒過程進行跟蹤取樣，測定餾分中乙醇的含量和δ13C值，結果見圖2。

圖2 精餾過程中乙醇含量和δ13C變化Fig.2 Change of δ13C values and ethanol content during rectification

由圖2可知，蒸酒過程中，隨著餾分中乙醇含量不斷降低，乙醇δ13C值也呈現(xiàn)不斷變小的趨勢，第一次與最后一次取樣的乙醇δ13C值差異達1.5‰，但對于可陳釀部分（50%vol～80%vol），乙醇的δ13C值平均為-28.48‰，與發(fā)酵醪中乙醇的（δ13C=-28.51‰）十分接近，因此可以斷定，盡管白蘭地生產(chǎn)時需用水對陳釀酒進行稀釋（至40%vol左右），但由于無外源乙醇的混入，天然白蘭地的乙醇δ13C值不再變化。

2.3 添加玉米酒精對白蘭地中乙醇δ13C的影響

以玉米酒精和蒸餾水為基礎配制與梨白蘭地濃度相同的乙醇水溶液，分別按比例5%、15%、30%、50%向梨白蘭地中加入上述乙醇水溶液，混合均勻后測定乙醇δ13C值，結果見圖3。

圖3 外源酒精添加比率與白蘭地中乙醇δ13C值(‰)的關系Fig.3 Linear relation between exogenous ethanol addition and δ13C values of brandy alcohol

由圖3可知，添加玉米酒精后，乙醇δ13C值出現(xiàn)明顯變化，且隨著玉米酒精比例的增加而逐漸偏正（R2=0.99）。表1結果表明，梨汁發(fā)酵乙醇δ13C值的自然波動范圍為-29‰～-27‰，當混入15%玉米酒精時樣品乙醇δ13C值則已超出95%的置信區(qū)間。

2.4 發(fā)酵前加入蔗糖對乙醇δ13C的影響

選擇北京地區(qū)的梨汁為研究對象，根據(jù)其糖濃度向梨汁中加入10%、30%、50%、70%、80%、90%甘蔗糖溶液，發(fā)酵后測定發(fā)酵液的乙醇δ13C值，結果見圖4。

圖4 外源蔗糖添加比率與白蘭地中乙醇δ13C的關系Fig.4 Linear relation between exogenous sucrose addition and δ13C values of brandy alcohol

由圖4可知，發(fā)酵液乙醇δ13C與甘蔗糖含量呈良好的線性正相關關系（R2=0.98），這是由于梨為C3植物，而甘蔗為C4植物，二者的糖中δ13C值明顯不同，因此，可利用乙醇δ13C值檢測來判斷發(fā)酵原料的真實屬性。因此乙醇δ13C值可作為白蘭地產(chǎn)品中酒精來源或發(fā)酵原料溯源的有效指示劑。

3 結論

本實驗研究了梨汁的糖和發(fā)酵液乙醇中δ13C值特征，梨汁的糖和乙醇明顯表現(xiàn)出C3植物的碳同位素分布特征，并且乙醇與糖的δ13C值具有良好的線性關系。而作為白蘭地生產(chǎn)特殊組成部分的蒸酒工藝，雖然出現(xiàn)了乙醇碳同位素分餾，但陳釀部分與發(fā)酵醪相比具有相同的乙醇δ13C值特征，因此乙醇δ13C值可作為白蘭地產(chǎn)品中酒精來源或發(fā)酵原料溯源的有效指示劑。模擬實驗表明，利用乙醇δ13C值可檢測出15%的玉米酒精，也能幫助判斷白蘭地的發(fā)酵原料中是否混入C4植物成分。本研究為酒類食品真實性的鑒別提供一個新的手段，適合推廣應用，同時也為進一步規(guī)范我國飲料酒生產(chǎn)提供技術支撐。需要說明的是，本研究僅調(diào)查分析了部分地區(qū)的梨的特征，由于植物糖分中碳同位素分布受眾多因素影響，選擇乙醇δ13C值作為客觀指標檢測各白蘭地產(chǎn)品中的玉米酒精或檢測生產(chǎn)原料中的C4植物糖（漿），還需詳盡的數(shù)據(jù)作為應用的基礎。

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