高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定嬰幼兒配方食品中葉酸的含量

竺 琴，蘇流坤，王 飛，農(nóng)云軍，石燕麗，梁迪思

（中國廣州分析測試中心 廣州化學(xué)危險應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510070）

葉酸是由碟啶、對氨基苯甲酸和數(shù)量不等的酪氨酸等三部分組成，是一種重要的B族維生素，參與核酸、蛋白質(zhì)的生物合成，與許多重要的生化過程密切相關(guān)。雖然葉酸天然的存在于部分食物當(dāng)中，但是其含量低，并多以多谷氨酸的形式存在，不能滿足人體需求，所以從20世紀90年代初期人們逐漸將葉酸作為添加劑適量的添加在一些強化食品和保健品中。葉酸對于孕婦和嬰幼兒有特殊的重要性，因此在其使用的食物中添加葉酸顯得尤為重要，GB 10765—2010《嬰幼兒配方食品》中規(guī)定了葉酸作為嬰兒配方食品添加物[1]，因此，準(zhǔn)確的測定葉酸的含量對產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、功效評價等有重要的意義。

目前，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.211—2008《食品中葉酸的測定》和GB 5413.16—2010《嬰幼兒配方食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）測定》中對食品和嬰兒食品和乳制品中葉酸的測定采樣微生物法[2-3]，此方法周期長，步驟繁瑣，重復(fù)性差，影響因素多。國內(nèi)外文獻中檢測葉酸含量多采樣紫外分光光度法、熒光法、液相色譜法（liquid chromatography，LC）、液相色譜熒光法、氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[4-10]，在嬰幼兒配方食品中，特別是乳制品，葉酸的含量低、基質(zhì)復(fù)雜、干擾大，難準(zhǔn)確測定，本實驗建立了高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定嬰幼兒配方食品中葉酸的方法，作為葉酸測定國標(biāo)方法的補充，其適應(yīng)范圍廣、分析時間短、靈敏度高，為嬰幼兒配方食品中葉酸的測定提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8種嬰幼兒配方食品（包括奶粉、米粉、多維片等）：市售。葉酸對照品、胰蛋白酶（12 000 U/g）：美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸（分析純）、乙酸（分析純）、乙酸銨（分析純）、三氯乙酸（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙醇（色譜純）：美國霍尼韋爾公司；水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100LC-Trap-XCT高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)（配有電噴霧離子源及Agilent Chem Stations數(shù)據(jù)處理軟件）：美國安捷倫公司；Sartorius BP61型電子天平（0.1 mg）：德國Sartorius公司；KQ-600E型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液，流動相B：甲醇；梯度：B相10%，8 min；B相55%，8.1 min；B相10%，15.0 min；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20μL；采樣柱后分流，分流比為1∶3（V/V）。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）：正離子模式；毛細管電壓5.0 kV，毛細管出口電壓109.4 V，霧化氣壓力：3.50×105Pa，干燥氣流速：10 L/min，干燥氣溫度：350 ℃，掃描方式：多離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），定量離子442.0→295.2。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取葉酸對照品0.1 g（精確到0.1 mg），加入2.5 mL 5%的Na2CO3，用蒸餾水溶解定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為1.00 g/L的葉酸儲備液。儲備液用蒸餾水稀釋成系列對照液供分析用。

1.3.4 樣品前處理

稱樣：將樣品混勻，準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g（精確到0.1 mg），加入0.5 g抗壞血酸，加入2.5 mL 5%Na2CO3，加入適量蒸餾水，超聲20 min。

脫脂和去蛋白：加入20 mL 0.1 mol/L HCl定容至100 mL（無脂和蛋白樣品不做此步驟），用蒸餾水定容至50.0 mL，再以3 500 r/min離心10 min，過濾，取清液1～2 mL過0.45 μm濾膜，進行液相色譜-質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的討論

葉酸穩(wěn)定性差，對熱、光線、酸性環(huán)境不穩(wěn)定，但葉酸在中性偏堿條件下比較穩(wěn)定，并且還原劑抗壞血酸對葉酸的穩(wěn)定性有明顯的保護作用[11]，因此在提取過程中添加抗壞血酸和Na2CO3溶液減少葉酸在檢測過程中的損失。葉酸為水溶性維生素，因此用水超聲浸提可達到滿意的提取效果，但是嬰兒配方奶粉中的成分復(fù)雜，奶粉中的蛋白質(zhì)等大分子化合物也會影響葉酸提取效率和色譜分離效果，因此適合的前處理顯得尤為重要，本實驗比較了乙腈（15 mL）、乙醇（15 mL）、乙酸（20 mL）、0.1 mol/L鹽酸（20 mL）、1%三氯乙酸（20 mL）、3%高氯酸（20 mL）5種試劑[12-13]及120 U/g胰蛋白酶液（20 mL）對蛋白的沉淀效果，結(jié)果見表1。

由表1可知，乙腈、乙醇和蛋白酶的去蛋白效果也很好，但是在去蛋白過程中葉酸損失較大，綜合考慮最終選擇0.1 mol/L HCl 20 mL處理樣品。

2.2 LC-MS條件的討論

[14-15]，采C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以5 mmol/L乙酸銨和甲醇作為流動相，進行梯度洗脫，葉酸的保留時間適中且峰形佳，適合定量分析。圖1為葉酸提取離子色譜圖（extracted ion chromatogram，EIC）。葉酸在電噴霧正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+，選擇[M+H]+進行產(chǎn)物離子掃描產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z 442.0→295.2，將m/z 295.2碎片離子作為定量離子。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)的葉酸提取離子色譜圖Fig.1 LC-MS chromatograms of folic acid for standard solution (A)and sample (B)

2.3 檢出限和定量限

取儲備液逐級稀釋，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后按照高效液相色譜和質(zhì)譜條件進行分析，進樣量為20 μL。以信噪比S/N=3計算葉酸的檢出限（limit of detection，LOD），信噪比S/N=10計算其定量限（limit of quantitation，LOQ），通過計算得到葉酸的LOD為1.0 ng/mL，LOQ為3.3 ng/mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取葉酸儲備液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.001 μg/mL、0.025 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL、1.000 μg/mL、2.500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=976 8.3X-11.0，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9，結(jié)果表明，葉酸在0.001～2.500 μg/mL的范圍內(nèi)，葉酸的質(zhì)量濃度和峰面積的線性關(guān)系良好，適合作為定量分析。

2.5 精密度和回收率實驗

圖2 葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of folic acid

分別取市售8種不同的嬰幼兒配方食品（包括奶粉、米粉、多維片等），按照本方法測定其中葉酸的本底含量，每個樣品平行測定6次，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。向樣品中分別加入10.0 μg、30.0 μg、100 μg的標(biāo)準(zhǔn)品，計算其加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 葉酸的精密度和回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of precision and recovery experiment of folic acid (n=6)

由表2可知，葉酸檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.6%～6.0%，加標(biāo)回收率為83.9%～104.0%。方法顯示了較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，能滿足實際樣品的分析要求。

3 結(jié)論

實驗采用高效液相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的方法，對嬰幼兒配方食品的葉酸進行測定。嬰幼兒配方食品中特別是奶制品中，葉酸的添加量低，并且樣品基質(zhì)復(fù)雜，利用質(zhì)譜的高選擇性和液相色譜的強分離能力，避免了樣品中雜質(zhì)的干擾、分析時間長等問題，簡化了操作步驟、縮短實驗周期。根據(jù)該方法對市場上的8種嬰兒配方食品進行定量分析，在0.001～2.500 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.998 9），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.6%～6.0%，回收率為83.9%～104.0%，檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為1.0 ng/mL、3.3 ng/mL，結(jié)果顯示該方法適用于嬰幼兒配方食品中葉酸的測定。該方法采用專屬性強的質(zhì)譜檢測器，靈敏度高，并聯(lián)用色譜分離方法，可以進行具有較復(fù)雜基質(zhì)、葉酸含量低的食品中葉酸的檢測。

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