普通蕎麥發(fā)芽種子的液態(tài)發(fā)酵蕎麥酒工藝研究

尉 杰，陳慶富*，郭菊卉

（貴州師范大學(xué) 植物遺傳育種研究所，蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001）

蕎麥（buckwheat）屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），一年生或多年生雙子葉草本植物，起源于我國西南地區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)的蕎麥約有23個物種[1]，兩個栽培種，一個是甜蕎（Fagopyrum esculentumMoench），一個是苦蕎（Fagopyrum tataricumL.Gaertn）。蕎麥具有獨(dú)特的食療、保健作用，在預(yù)防和治療高血壓、冠心病、糖尿病、肥胖等“現(xiàn)代文明病”，增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗衰老以及改善亞健康狀態(tài)等方面都有積極的作用，因此具有較高的開發(fā)價值。蕎麥中的蘆丁含量是其他糧食作物難以媲美的，甜蕎種子的黃酮類化合物含量一般在0.02%～0.789%之間，苦蕎黃酮類化合物含量在1.08%～3.6%之間[2]。蕎麥中淀粉含量達(dá)到60%以上，因此蕎麥?zhǔn)且环N良好的釀酒原料[3]。

傳統(tǒng)的高度酒刺激性強(qiáng)，酒性烈，長期飲用容易使人產(chǎn)生依賴性而且對腦、膽、口腔、腸胃、胰腺和肝臟等部位有損傷[4]。相比之下低度酒具有刺激性小，適量飲用具有興奮神經(jīng)，刺激食欲，生津補(bǔ)血的功效，并能增加血液中高密度脂蛋白，使膽汁、膽固醇含量減少，對于預(yù)防動脈硬化、高血脂有積極幫助，還能消除累積在動脈血管壁上的膽固醇，保護(hù)心血管[5]。營養(yǎng)和保健作用較強(qiáng)的低度酒是現(xiàn)代酒業(yè)發(fā)展的重要方向。蕎麥由于富含黃酮類成分、特定活性多肽等保健成分，是生產(chǎn)保健酒的良好原料。

目前蕎麥保健酒的釀制方法主要采用發(fā)酵后蒸餾的方法和液態(tài)發(fā)酵法[6-7]。蒸餾方法可使酒液澄清透明、提升純度，還可大幅提升酒液酒精度、口感及防腐能力。但黃酮類物質(zhì)是醇溶性的，極難通過蒸餾方式進(jìn)入酒中，因此蒸餾酒中黃酮含量極低。因此采用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蕎麥酒的工藝具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，即可以把原料中的營養(yǎng)和保健成分溶入酒產(chǎn)品中，大幅提升酒產(chǎn)品的營養(yǎng)和保健品質(zhì)。

蕎麥種子發(fā)芽的過程中，在自身酶的作用下，部分淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性的糖類，同時也合成大量的黃酮類物質(zhì)。蕎麥種子發(fā)芽后黃酮含量會大幅上升，因此利用發(fā)芽蕎麥種子最終釀得酒液中總黃酮含量比未經(jīng)發(fā)芽處理的提高一倍以上[8]。

本研究擬通過液態(tài)發(fā)酵法，以豐甜一號甜蕎麥種子為原料，采用發(fā)芽的方式最大化地提高原料利用率，同時規(guī)避其它工藝的不足，優(yōu)化蕎麥酒的釀制工藝，以期為蕎麥酒的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐甜1號蕎麥種子：貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心；調(diào)硫片：法國LAFFOT公司；α-淀粉酶、糖化酶：北京索萊寶科技有限公司；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋清粉：法國LAFFOT公司；食鹽：市售；葡萄糖、無水硫酸鈉、HCl、冰乙酸等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-800-G型光照培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；755B型紫外可見分光光度計(jì)：上海金鵬有限公司；WGL-45（B）型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；pHS-3C 型pH酸度計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

蕎麥篩選與批量發(fā)芽：篩選品質(zhì)優(yōu)良的豐甜一號蕎麥種子淘洗潔凈，將種子平攤放入墊有紗布的托盤中加入適量無菌水，調(diào)節(jié)光照培養(yǎng)箱溫度至23 ℃進(jìn)行發(fā)芽。發(fā)芽過程中每隔6 h檢查加水使蕎麥保持濕潤，3～5 d后芽長約0.5 cm時結(jié)束發(fā)芽。

蕎麥芽烘干與粉碎：用濾紙包裹蕎麥芽，采用60 ℃鼓風(fēng)烘干24 h可獲得成色較好的烘干物。使用高速萬能粉碎機(jī)粉碎20 s。另外，發(fā)酵過程中蕎麥皮中的色素會進(jìn)入發(fā)酵液從而影響最終酒色，對粉碎物過40目篩以篩掉大部分麥皮殼。

液化糖化：加入0.6%α-淀粉酶充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0 ℃保溫30 min進(jìn)行液化。向醪液中加入乙酸或檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為4.5，同時加入6%糖化酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?5 ℃保溫40 min進(jìn)行糖化。

發(fā)酵：取0.6%的干酵母于0.5%的葡萄糖溶液中，30 ℃活化30 min。轉(zhuǎn)移醪液至發(fā)酵瓶，在醪液加入無菌水調(diào)至料水比1∶4.0（g∶mL）。待醪液冷卻至30 ℃左右，加入已活化的酵母，按0.3 g/L加入調(diào)硫片攪拌1 min使酵母與醪液充分混勻。然后密封發(fā)酵瓶，將發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱，以32 ℃恒溫發(fā)酵，每24 h進(jìn)行一次攪拌。第二天開始每24 h測定記錄一次酒精度。

過濾及澄清：將醪液用3層紗布進(jìn)行初步過濾，過濾過程需要適當(dāng)加壓。對過濾后的酒液裝瓶密封置于恒溫水浴鍋中，將溫度調(diào)至95 ℃進(jìn)行加熱，時間為6 min。待酒液冷卻后以1.2 g/L的比例加入蛋清粉作為澄清劑（加蛋清粉時可加少許食鹽以幫助蛋清粉溶解）密封后常溫下反應(yīng)5 d。將酒液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，置入低速大容量離心機(jī)以5 000 r/min離心30 min，取上清液進(jìn)行灌裝。

滅菌試驗(yàn)及老熟：對酒液以121 ℃滅菌12 min，將經(jīng)過封裝滅菌后酒液置于15 ℃下老熟30 min左右。

1.3.2 分析檢測方法

酒精度測定方法采用酒精度計(jì)法[9]，總黃酮含量測定方法采用紫外分光光度法，pH計(jì)法測定總酸[9]，皂化法測定總酯[9]。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

最佳料水比的確定：在醪液加入無菌水調(diào)至料水比為1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5（g∶mL），6%的酵母添加量，發(fā)酵時間8 d，發(fā)酵溫度為30 ℃進(jìn)行最佳料水比的確定試驗(yàn)。

最佳酵母添加量的確定：分別以不同酵母添加量3%、4%、5%、6%、7%進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，在料水比1∶4.0（g∶mL），發(fā)酵時間8 d，發(fā)酵溫度為30 ℃進(jìn)行酵母最佳添加量試驗(yàn)。

最佳發(fā)酵溫度的確定：設(shè)置24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃五個溫度梯度，1∶4.0（g∶mL）的料水比，發(fā)酵時間8 d，6%的酵母添加量，進(jìn)行最適發(fā)酵溫度的確定試驗(yàn)。

最佳發(fā)酵時間的確定：設(shè)置發(fā)酵時間為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，在料水比1∶4.0（g∶mL），酵母添加量為6%，溫度30 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，測定記錄酒精度，進(jìn)行最佳發(fā)酵時間確定試驗(yàn)。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)分析確定發(fā)酵最佳工藝。以酒精度作為評價指標(biāo)，以料水比、酵母添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

1.3.5 澄清過程中熱變性時間的探究

大多數(shù)蛋白質(zhì)在0～4 ℃時較穩(wěn)定，當(dāng)溫度加熱到80 ℃以上時蛋白質(zhì)會變性析出，而且大多數(shù)蛋白質(zhì)的熱變性是不可逆的。因此，采用加熱方法析出酒液蛋白質(zhì)，以使酒液澄清。采用95 ℃保溫，保溫時間分別為4 min、5 min、6 min、7 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.6 滅菌時間探究

以121 ℃對酒液進(jìn)行滅菌，滅菌30 min時酒液冷卻后酒液色度加深非常嚴(yán)重，呈深棕色，因此分別控制滅菌時間為6 min、9 min、12 min、15 min進(jìn)行滅菌試驗(yàn)，滅菌后對酒液常溫保存15 d，觀察滅菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）料水比的確定

以酒精度作為評價指標(biāo)，進(jìn)行最適料水比確定試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 料水比對發(fā)酵產(chǎn)生酒精度的影響Fig.1 Effect of material to water ratio on alcohol content

由圖1可知，在料水比為1∶4.0（g∶mL）的時候可獲得最高的酒精產(chǎn)量。料水比與發(fā)酵醪液的濃度直接相關(guān)，料水比較低時發(fā)酵醪液中糖濃度過高形成高滲透壓以及低水活性的環(huán)境，不利于酵母生長繁殖以及發(fā)酵生產(chǎn)酒精，導(dǎo)致產(chǎn)酒率下降[10]。料水比過高會稀釋醪液，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后酒液酒精度較低。

（2）酵母最佳添加量的確定

以酒精度作為評價指標(biāo)，進(jìn)行最適酵母添加量試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 酵母添加量對酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast addition on alcohol content

由圖2可知，酵母添加量在6%時，酒精產(chǎn)量最高。添加量過高或過低都會對酒精產(chǎn)量有所影響。酵母添加量不足時，醪液中酵母菌數(shù)量較少，不能充分滿足發(fā)酵需求。酵母添加量過高時，酵母菌迅速繁殖，醪液中的糖分被酵母菌的生命活動消耗[11]。

（3）最佳發(fā)酵溫度的確定

以酒精度作為評價指標(biāo)，進(jìn)行最佳發(fā)酵溫度試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，溫度在30 ℃時，酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精量最多。微生物靠酶的催化進(jìn)行生化反應(yīng)，溫度對酶的活性有著至關(guān)重要的影響[12]。溫度對酵母進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精具有重要作用，不同種類的酵母菌有不同的最佳發(fā)酵溫度，試驗(yàn)所用酵母釀酒最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

（4）最佳發(fā)酵時間的確定

以酒精度作為評價指標(biāo)，進(jìn)行最佳發(fā)酵時間試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖4可知，發(fā)酵第8天之后酒精含量已幾乎不再增加，這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醪液中黃酮含量以及酒精含量都在不斷增加，黃酮及酒精都對酵母菌的生長繁殖具有抑制作用[13]。因此，發(fā)酵8 d即達(dá)到該酵母生產(chǎn)酒精的極限，即最佳發(fā)酵時間為8 d。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，所得結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響因素主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即料水比對酒精度的影響最大，發(fā)酵溫度次之，酵母添加量與發(fā)酵時間對最終酒精產(chǎn)量影響較小。最佳處理方案為A2B2C1D2，即最佳發(fā)酵條件為料水比1∶4.0（g∶mL），酵母添加量5%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間8 d。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，蕎麥酒的酒精度為13.50%vol。

由表3可知，不同因素變異源的誤差列極差小，說明試驗(yàn)誤差較小；料水比對發(fā)酵液酒精含量影響極顯著，發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酒精含量影響顯著，酵母添加量及發(fā)酵時間對發(fā)酵液酒精含量影響較小。

2.3 澄清過程中熱變性時間確定

蕎麥酒在澄清過程采用95 ℃保溫不同時間，對澄清效果的影響結(jié)果見表4。

表4 熱變性時間對沉淀效果的影響Table 4 Effect of thermal denaturation time on sedimentation

由表4可知，熱變性4 min時沉淀不完全，時間提高到5 min后沉淀呈絮狀，加熱6 min沉淀效果已比較理想。繼續(xù)增加加熱時間沉淀效果已沒有明顯提高，即熱變性的最佳時間為6 min。

2.4 滅菌試驗(yàn)

以121 ℃對酒液進(jìn)行滅菌，滅菌后對酒液常溫保存15 d，不同的時間對滅菌效果的影響結(jié)果見表5。

表5 滅菌時間對滅菌效果的影響Table 5 Effect of sterilization time on sterilization

由表5可知，酒液滅菌6 min、9 min時保存15 d都會有染菌現(xiàn)象。滅菌12 min時，保存15 d無任何染菌現(xiàn)象，而且顏色變化較輕，在可接受范圍內(nèi)。滅菌15 min顏色加深較重，因此滅菌的時間選擇為12 min。

3 結(jié)論

對蕎麥通過液態(tài)發(fā)酵法釀酒的工藝進(jìn)行探究，得到蕎麥酒的最佳釀制工藝為蕎麥芽經(jīng)發(fā)芽打粉后，添加5%的酵母菌，以1∶4.0（g∶mL）的料水比，在發(fā)酵溫度為30 ℃條件下發(fā)酵8 d。在此條件下，蕎麥酒酒精度為13.50%vol。經(jīng)過壓榨過濾、澄清、滅菌等工序，釀制出的蕎麥酒色澤呈黃棕色，同時具有糧食特有的醇香與焦香味，總黃酮含量為268.97 μg/mL。

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