功能性紅曲中三類主要聚酮類化合物合成途徑相關(guān)基因研究進(jìn)展

陳 泉，吳遠(yuǎn)征，趙曉燕，趙吉興，李 耀，李紀(jì)順*

（1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中惠食品有限公司，山東 惠民 251706）

紅曲又稱月曲、神曲、紅曲米，是以紅曲霉為主發(fā)酵生產(chǎn)的一種獨(dú)特的米曲，在我國(guó)已有1 000多年的歷史，中國(guó)古代諸多書籍中都記載了紅曲具有著色、防腐、保健、醫(yī)藥等作用。近年來，隨著人們對(duì)紅曲藥用、生理價(jià)值的深入研究，人們已經(jīng)開發(fā)出對(duì)高血壓、高血脂等具有顯著療效的功能性紅曲產(chǎn)品。

功能性紅曲是指以大米等為原料，利用純培養(yǎng)的紅曲霉發(fā)酵生成的含發(fā)酵自然產(chǎn)生的洛伐他汀等生物活性物質(zhì)的紅曲。功能性紅曲中發(fā)揮降血壓、降血脂等作用的主要是紅曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，而在這些次級(jí)代謝產(chǎn)物中，影響功能性紅曲品質(zhì)的是三類主要的聚酮類化合物：洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素。洛伐他汀是紅曲中主要的降脂因子，輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》把洛伐他汀作為功能紅曲的特征性功能成分，要求洛伐他汀的含量必須＞0.4%[1]。目前，功能性紅曲產(chǎn)品的價(jià)格高昂并以洛伐他汀的含量高低而定。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.222—2008《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定》規(guī)定了紅曲產(chǎn)品中桔霉素的測(cè)定方法，本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)液態(tài)樣品中桔霉素的含量的定量限為50 μg/L，固態(tài)樣品為l mg/kg[2]，輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847—2007規(guī)定功能性紅曲米（粉）中的桔霉素含量（以絕干計(jì)）≤50 μg/kg[1]。

為了提高功能性紅曲的品質(zhì)，研究人員圍繞這三類聚酮類化合物在誘變育種、原生質(zhì)體融合育種以及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面進(jìn)行了大量深入細(xì)致的研究工作[3-5]。而隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究人員逐漸將重點(diǎn)放在對(duì)這三類化合物合成途徑相關(guān)基因的研究上，這樣有利于深入理解它們各自的合成途徑，為從根本上提高功能性紅曲產(chǎn)品的品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本文對(duì)目前報(bào)道的洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素合成途徑中相關(guān)基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，有利于促進(jìn)基因工程技術(shù)在功能性紅曲產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)中發(fā)揮更加重要的作用。

2 三種聚酮類化合物研究

2.1 洛伐他汀

對(duì)于洛伐他汀生物合成途徑及相關(guān)酶和基因的最初認(rèn)識(shí)主要源于對(duì)土曲霉的研究[6]。研究發(fā)現(xiàn)，參與土曲霉洛伐他汀合成途徑的酶包括：兩個(gè)多聚乙酰合成酶洛伐他汀二酮體合成酶（lovastatin diketone synthetase，LDKS）和洛伐他汀九酮體合成酶（lovastatin nonaketide synthetase，LNKS）（分別由lovB和lovF基因編碼）、轉(zhuǎn)酯酶（由lovD基因編碼）、烯酯酰還原酶（由lovC基因編碼）和P450單加氧酶（由lovA基因編碼）[7-9]。其具體合成途徑如圖1所示。LNKS和LDKS均含有酮合成酶（ketosynthase，KS）、?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、酮還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH）、?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）及甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，MeT）功能域，并分別參與合成洛伐他汀九酮主體和二酮側(cè)鏈，再由lovD編碼的轉(zhuǎn)酯酶將二者連接起來合成洛伐他汀[10]。

圖1 洛伐他汀的生物合成途徑[6]Fig.1 Biosynthetic pathway of lovastatin

2008年，CHEN Y P等[11]利用土曲霉中l(wèi)ovB基因的保守序列為探針，從叢毛紅曲霉（Monacus pilosus）BCRC38072的人工染色體文庫(kù)中克隆到一段42 kbp的DNA序列（GenBank No.DQ176595）。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段為一個(gè)包含與土曲霉洛伐他汀合成基因高度同源的基因片段mokA-mokI的洛伐他汀合成基因簇（表1）。經(jīng)氨基酸序列分析證實(shí)，mokA和mokB都含有同土曲霉中多聚乙酰合成酶結(jié)構(gòu)相近的KS、AT、DH、MeT、KR功能域。另外，CHEN Y P等[11]還利用基因打靶載體敲除了叢毛紅曲霉BCRC38072中的mokA基因，mokA基因缺失菌株經(jīng)發(fā)酵后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其不再有合成洛伐他汀的能力，這進(jìn)一步證實(shí)了mokA在參與洛伐他汀合成中的作用。隨后，SAKAI K等[12]在敲除了叢毛紅曲霉中的mokB基因后發(fā)現(xiàn)，在該叢毛紅曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物中雖然檢測(cè)不到洛伐他汀，但是卻有洛伐他汀的前體物莫納可林的存在。這說明mokB是參與洛伐他汀二酮側(cè)鏈的合成，印證了之前CHEN Y P等[11]的氨基酸序列分析結(jié)果。

表1 紅曲霉洛伐他汀生物合成基因簇分析[6]Table 1 Gene cluster of lovastatin biosynthetic in Monascus

為了進(jìn)一步證實(shí)上述分析結(jié)果，2009年，CHEN Y P等[13]又利用叢毛紅曲霉內(nèi)源的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子的mokH超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化叢毛紅曲霉BCRC38072，篩選得到3個(gè)mokH基因多拷貝菌株。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mokH基因多拷貝菌株合成洛伐他汀的能力提高了2倍左右。而且，通過PT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，mokH基因多拷貝菌株中洛伐他汀合成相關(guān)基因的表達(dá)均早于出發(fā)菌株，證實(shí)了mokH作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)洛伐他汀合成基因的正調(diào)控作用。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)laeA編碼的調(diào)控因子對(duì)于曲霉屬的洛伐他汀合成也具有調(diào)控作用。BOK J W等[14]研究了構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的laeA基因?qū)υ谄洚愒幢磉_(dá)的洛伐他汀合成基因的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除laeA基因的菌株，lovC和lovE表達(dá)量明顯降低，莫納可林的產(chǎn)量也隨之下降；而過量表達(dá)laeA基因的菌株lovC和lovE表達(dá)量顯著提高，莫納可林的產(chǎn)量提高了4倍。最后，在土曲霉中過量表達(dá)了來源于構(gòu)巢曲霉的laeA基因，發(fā)現(xiàn)洛伐他汀的產(chǎn)量提高了4～7倍。紅曲霉中也存在類似的調(diào)控因子MplaeA。ZHANG M Y等[15]研究了紅曲霉中MplaeA的兩種mRNA（d-MplaeA和l-MplaeA）的選擇性拼接方式，發(fā)現(xiàn)MplaeA對(duì)紅曲霉洛伐他汀的合成能力具有明顯的調(diào)控作用。

2.2 桔霉素

1999年，HAJJAJ H等[16]利用13C標(biāo)記乙酸的方式證實(shí)，桔霉素的合成起始于多聚乙酰的合成，其具體合成途徑如圖2所示。對(duì)桔霉素合成相關(guān)基因的研究最早開始于2005年，SHIMIZU T等[17]利用簡(jiǎn)并引物從紫色紅曲霉（M.purpureus）中克隆得到了全長(zhǎng)為7 838 bp的一段DNA片段，該片段編碼包含KS、AT、ACP和一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的由2 593個(gè)氨基酸組成的蛋白功能域，該片段后來被命名為pksCT（GenBank No.AB167465）。隨后，研究人員敲除了紫色紅曲霉中的這段pksCT基因編碼的KS功能域或ACP功能域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除后菌株不再產(chǎn)生桔霉素，而且其色素產(chǎn)量也未受到影響。這說明pksCT基因指導(dǎo)紫色紅曲霉中桔霉素前體多聚乙酰的合成。

圖2 桔霉素生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathway of citrinin

2007年，SHIMIZU T等[18]又克隆出了一段長(zhǎng)為21 kbp的包括pksCT及其側(cè)翼的序列，并研究發(fā)現(xiàn)由ctnA編碼的一段576個(gè)氨基酸組成的蛋白序列控制pksCT和orf5的轉(zhuǎn)錄，是桔霉素合成的主要轉(zhuǎn)錄激活因子。2008年，SAKAI K等[19]構(gòu)建了桔霉素合成的異源表達(dá)系統(tǒng)，將桔霉素合成基因簇轉(zhuǎn)入米曲霉（Aspergillus oryzae）中，獲得可以穩(wěn)定產(chǎn)生桔霉素的菌株。為了降低紅曲霉中桔霉素的含量，研究者利用基因工程技術(shù)敲除桔霉素合成的相關(guān)基因，并取得了不錯(cuò)的效果。FU G[20]等利用潮霉素選擇性標(biāo)記置換橙色紅曲霉Li AS3.4384中的pksCT序列，使桔霉素的含量降低了98%；JIA X Q等[21]同樣敲除了紫色紅曲霉SM001中的pksCT基因，獲得了一株不產(chǎn)桔霉素的工程菌；LI Y P等[22]敲除了橙色紅曲霉Li AS3.4384中的ctnB基因，該基因位于pksCT和ctnA基因之間，編碼的是一個(gè)氧化還原酶。得到的ctnB基因缺陷型菌株基本檢測(cè)不到桔霉素的產(chǎn)生；周禮紅[23]通過GenBank公布的紫色紅曲霉桔霉素聚酮體編碼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到紅色紅曲霉CICC5006的桔霉素合成酶相關(guān)基因序列，構(gòu)建了pBpksCTIHygro載體以及通過其中的酮酯酰合成酶的N 端序列構(gòu)建的pBpksCW2Hygro分別破壞pksCT基因，均實(shí)現(xiàn)了桔霉素合成的阻斷；徐民俊[24]利用ctnR的無效等位基因片段置換紫色紅曲霉中的ctnR轉(zhuǎn)錄激活因子，在不引入外源抗性基因的情況下使紫色紅曲霉產(chǎn)生的桔霉素含量減少近50%。

2.3 紅曲色素

紅曲色素廣泛應(yīng)用于腌制品和肉制品的著色防腐，具有保健功效和藥用價(jià)值，在世界各地都有巨大的市場(chǎng)，在東南亞國(guó)家的應(yīng)用尤為廣泛[25-27]。目前已知的紅曲色素主要有10種，包括6種醇溶性色素和4種水溶性色素，在顏色上主要有紅色、黃色和橙色3種。紅曲色素的合成過程與洛伐他汀和桔霉素的合成過程類似，以紅斑紅曲素為例展示的紅曲色素的合成過程見圖3[28]。首先由1 mol丁烯酰輔酶A（coenzyme A，CoA）和4 mol丙二酰CoA在聚酮合酶的作用下生成六聚酮化合物，隨后由脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生的己酸與六酮聚酮化合物經(jīng)醛醇縮合。最后，經(jīng)脫水反應(yīng)生成紅曲玉紅素。對(duì)紅曲色素合成過程相關(guān)基因的研究起步較晚，在這方面的研究也一直處于有爭(zhēng)議的階段。

圖3 紅曲色素(以紅斑紅曲素為例)生物合成途徑Fig.3 Biosynthetic pathway of Monascus pigment (rubropunctatin as a case)

直至2013年，BALAKRISHNAN B等[28]分析利用三螺旋DNA（T-DNA）隨機(jī)突變紫色紅曲霉得到的白化突變株W13后發(fā)現(xiàn)，該菌株內(nèi)的一個(gè)編碼聚酮合酶的基因MpPKS5以及與之相鄰的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因mppR1的表達(dá)水平明顯下調(diào)。隨后，又針對(duì)性地表達(dá)失活MpPKS5后也得到了不產(chǎn)紅曲色素的菌株。因此，認(rèn)為MpPKS5和mppR1都是紅曲色素合成基因簇中的一員。然后，通過與GenBank公布的叢毛紅曲霉（因?yàn)樽仙t曲霉目前沒有較完整的基因組序列信息）的基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，基因簇應(yīng)該為叢毛紅曲霉的紅曲色素合成基因簇。該基因簇包含：聚肽合酶、脂肪素合酶、轉(zhuǎn)錄激活因子、?；D(zhuǎn)移酶、氧化還原酶、羥基化酶等不同功能的酶。隨后，XIE N等[29]利用單側(cè)寡聚核苷酸嵌套-PCR（SON-PCR）從紅色紅曲霉中克隆到一段56 000 bp的紅曲色素合成酶基因簇，該基因簇包含有聚酮酶基因、脂肪酸合酶基因、酯酶基因、脫水酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和一個(gè)調(diào)節(jié)基因pigR。將pigR基因敲除后發(fā)現(xiàn)紅曲霉不再具有合成紅曲色素的能力。而LIU Q等[30]在敲除紅色紅曲霉（M.ruber）中的一個(gè)編碼黃曲霉毒素醛還原酶的MpigE基因之后，獲得的缺陷株只能產(chǎn)生黃色色素和極少量的紅色色素，而出發(fā)菌株卻能夠產(chǎn)生紅色、黃色和橙色三種顏色的色素。將MpigE基因在上述缺陷菌株中回補(bǔ)表達(dá)后，紅曲霉又恢復(fù)了合成紅色和橙色色素的能力。這表明MpigE基因可能參與各種色素組分之間的轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)在過量表達(dá)MpigE基因后，紅曲霉產(chǎn)生的桔霉素產(chǎn)量大幅降低。

圖4 紅曲霉紅曲色素生物合成相關(guān)基因簇Fig.4 Monascus pigment biosynthetic related gene cluster in Monascus

3 前景與展望

洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素是影響功能性紅曲產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，現(xiàn)階段控制它們產(chǎn)量的方法還多數(shù)停留在誘變育種和優(yōu)化發(fā)酵策略兩種方式上。這造成研究和生產(chǎn)都具有一定程度的偶然性和盲目性，不利于功能性紅曲產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。文章從分子生物學(xué)角度對(duì)目前報(bào)道的洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素的合成過程及合成途徑相關(guān)基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，有利于更加深入的了解其合成過程，以期通過有效的手段大幅度提高功能性紅曲產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，將會(huì)成為未來的發(fā)展重點(diǎn)和熱點(diǎn)。然而，相對(duì)于大部分工業(yè)化菌株來說，對(duì)紅曲霉菌株基因功能方面的研究還處于初期階段，相信隨著科學(xué)的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)于紅曲霉基因功能的研究將更加深入和透徹，基因工程技術(shù)和代謝工程技術(shù)也會(huì)在紅曲霉產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)揮越來越多的作用。

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