槲皮素對人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞增殖的抑制作用

徐曉　劉進(jìn)　張珂

槲皮素對人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞增殖的抑制作用

徐曉劉進(jìn)張珂

【摘要】目的觀察槲皮素對人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法以不同濃度槲皮素培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞后，采用MTT法檢測槲皮素對細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化；通過倒置顯微鏡、Heochst33258熒光染色、透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；Western blot方法檢測凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)情況。 結(jié)果不同濃度槲皮素作用于人肺腺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率顯著降低，且與劑量呈依賴關(guān)系。15、30、60μmol/L的槲皮素作用于人肺腺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞24h后，細(xì)胞阻滯發(fā)生在G2/M期；凋亡率分別為（7.24±1.73）%、（12.57±2.7）%和（26.02± 1.67）%，與濃度為0的凋亡率[（2.67±2.32）%]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；從形態(tài)學(xué)上觀察到肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著槲皮素作用濃度的增加Survivin蛋白的表達(dá)逐漸降低。 結(jié)論槲皮素對人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞株有抑制其增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯及抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肺癌槲皮素細(xì)胞凋亡Survivin

肺癌是在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%~85%，約45%的患者就診時已是ⅢA/B期[1]。肺癌患者的治療現(xiàn)狀不容樂觀，由于早期診斷率較低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移；而耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生更為棘手，即便是當(dāng)前最好的治療方案，也只有早期肺癌患者的治愈率較高。傳統(tǒng)手術(shù)、放化療等仍是目前治療肺癌的主要模式，但其5年生存率＜5%。盡管許多傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物已被用于治療NSCLC，如長春地辛、多西他賽、卡鉑等[2]，但因不良反應(yīng)較明顯而使其治療作用降低。中藥在治療惡性腫瘤中因表現(xiàn)出其增效減毒作用而備受關(guān)注，但缺乏具體的藥效機(jī)制、安全性及毒性等相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床研究，應(yīng)用受到限制。近年來，槲皮素抗腫瘤作用逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)，而Survivin是具有腫瘤特異性的凋亡抑制蛋白，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。筆者通過體外細(xì)胞學(xué)檢測凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)來評估槲皮素是否具有抗肺癌活性，從而推測槲皮素治療肺癌的潛在可能性，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料人肺腺癌細(xì)胞株A-549購于上海中科院細(xì)胞生物研究所；槲皮素（美國Sigma公司），噻唑藍(lán)(MTT)（上海Fluka公司），兔抗鼠Survivin抗體（美國Cell Signaling公司），超凈工作臺（新加坡ESCO公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司），倒置顯微鏡（德國Leica公司），流式細(xì)胞儀（美國Couher公司），酶標(biāo)儀（德國BMG公司），微量加樣器，一次性微孔濾器（0.22μm），離心管，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar公司），紫外燈，冰箱。

1.2方法

1.2.1槲皮素對細(xì)胞株A-549體外增殖的影響試驗(yàn)組設(shè)有空白對照組（細(xì)胞培養(yǎng)液中不加藥）、給藥試驗(yàn)組（細(xì)胞培養(yǎng)液中含10、20、40、60、80、100、120μmol/L槲皮素）。由于槲皮素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，為避免DMSO對實(shí)驗(yàn)的影響，設(shè)溶劑對照組（細(xì)胞培養(yǎng)液中含0.05%DMSO），每組5孔。取對數(shù)生長期的A-549細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制成腫瘤細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中（1×104/孔），培養(yǎng)液體積為150μl/孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后，用含不同濃度的槲皮素培養(yǎng)4d，在每孔中加入5mg/ml的MTT溶液20μl，孵育4h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100μl，在搖床搖動15min，置于酶標(biāo)儀中，波長 570nm，計(jì)算腫瘤細(xì)胞的生長抑制率，抑制率（%）=（1-給藥實(shí)驗(yàn)組A值/溶劑對照組A值）×100%（A值為吸光度值）。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡取對數(shù)生長期A-549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的初濃度至1×105個/ml并加入24孔板，每孔2ml，細(xì)胞貼壁后加入不同劑量的槲皮素，使其終濃度為15、30、60μmol/L，每孔容量均為2ml，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔，不加藥為對照組。培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，10ml PBS洗滌3次，1 000r/min，持續(xù)5 min，棄上清液，加入100μl PI染液50μg/ml，置入溫箱內(nèi)避光40min，放入4℃冰箱過夜，上流式細(xì)胞儀，經(jīng)MODFIT軟件去除細(xì)胞碎屑后檢測周期分布及細(xì)胞凋亡，CellQuest軟件記錄、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3倒置顯微鏡觀察將A-549細(xì)胞與不同濃度槲皮素作用后置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察。將單純培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞作為對照組。

1.2.4熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞爬片培養(yǎng)4h后分為兩組，實(shí)驗(yàn)組加入30μmol/L濃度的槲皮素，對照組加入和實(shí)驗(yàn)組等量的溶液于RPMI 1640培養(yǎng)液中。干預(yù)24h后加Heochst33258熒光染色，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察，攝像。

1.2.5透射電鏡將30μmol/L槲皮素作用A-549細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，離心，棄上清液，剩下的細(xì)胞團(tuán)用15%戊二醛/PBS固定2h；PBS漂洗3次，15min/次；1%鋨酸后固定1h；梯度丙酮脫水；Epon-812混合樹脂包埋；超薄切片機(jī)切片；醋酸鈉和檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察、照相。

1.2.6Western blot檢測細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平細(xì)胞與不同濃度（15、30、60μmol/L）槲皮素培養(yǎng)24h后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。每孔加入100μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，行麗春紅染色，根據(jù)蛋白Marker以確定轉(zhuǎn)膜效果及靶蛋白的位置。PVDF膜5%BSA中37℃封閉1h，Survivin兔抗鼠單克隆抗體（1∶250）37℃溫育1h，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體37℃溫育1h，利用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)、曝光，Survivin蛋白相對分子質(zhì)量為29 000，以上每個濃度重復(fù)3遍。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1槲皮素對A-549細(xì)胞增殖的影響溶劑對照組對A-549細(xì)胞株增殖影響極小，槲皮素對A-549細(xì)胞株增殖有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，詳見表1。

表1　槲皮素對A-549細(xì)胞株增殖的抑制作用

2.2細(xì)胞周期的分布和凋亡情況槲皮素可通過阻滯細(xì)胞周期由G2/M期向G1期的進(jìn)程，造成G2/M期細(xì)胞堆積阻滯，各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。每個樣品計(jì)數(shù)1×105個細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀，在G0/G1期前出現(xiàn)一亞二倍體峰，確認(rèn)為凋亡峰，該峰面積與槲皮素呈劑量-時間依賴性。同時細(xì)胞流式儀檢測顯示隨著槲皮素作用濃度的增大和作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見表2、圖1。

表2　不同給藥劑量組槲皮素對A-549細(xì)胞周期及凋亡的影響

2.3形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察到對照組細(xì)胞貼壁生長，呈單層鵝卵石樣緊密排列，形態(tài)不規(guī)則，有較長的偽足，可融合成集落，細(xì)胞分裂增殖旺盛，有多量瘤巨細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)槲皮素處理后，細(xì)胞偽足回縮，細(xì)胞變小、圓，細(xì)胞排列雜亂，或松散或聚集成團(tuán)，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象，瘤巨細(xì)胞減少或不見巨細(xì)胞，且存在時間和劑量依賴性，見圖2（插頁）。

2.3.2Heochst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況對照組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞大小均勻、飽滿、胞膜完整。30μmol/ L槲皮素作用24h后，凋亡細(xì)胞增多，核質(zhì)濃縮、形成凋亡小體，見圖3（插頁）。

2.3.3透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變透射電鏡下，肺癌細(xì)胞則核大而形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)很少，核仁大而致密，癌細(xì)胞表面有許多大小、形狀不一的突起，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。體外培養(yǎng)A-549肺癌細(xì)胞與30μmol/L槲皮素作用24h后，可見到肺癌細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)濃縮的異染色質(zhì)，核仁分解為許多嗜鋨酸的細(xì)小顆粒，分布于核中央，核膜已經(jīng)模糊不清，胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜開始破壞，嵴變短且數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，但細(xì)胞膜完整的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，見圖4（插頁）。

2.4各組A-549細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平15、30、60μmol/L槲皮素作用 24 h后蛋白樣品的Survivin/ actin灰度值比分別為 0.89±0.11、0.69±0.13、0.56± 0.10，與未處理組的灰度值比0.97±0.02比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而且槲皮素濃度15μmol/L與30μmol/L、30μmol/L與60μmol/L比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖1　24h槲皮素作用于肺癌A-549細(xì)胞周期及凋亡變化（A：空白組；B：15μmol/L槲皮素；C：30μmol/L槲皮素；D：60μmol/L槲皮素）

圖2　不同濃度重樓醇提取物作用于肺癌A-549細(xì)胞24h形態(tài)（A：對照組；B：15μmol/L槲皮素；C：30μmol/L槲皮素；D：60μmol/L槲皮素；×400）

圖3　Hoechst33258染色的凋亡細(xì)胞形態(tài)（A：對照組；B：30μmol/L　

圖4　透射電鏡觀察槲皮素誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞形態(tài)（A：×60 000；

圖5　Western blot檢測各處理組A-549細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平（A：0；B：15μmol/L；C：30μmol/L；D：60μmol/L）

3　討論

肺癌在全世界范圍內(nèi)成為導(dǎo)致癌癥死亡的首要原因，根據(jù)2001—2007年對美國患者的統(tǒng)計(jì)，診斷為NSCLC晚期階段的患者5年存活率為3.6%。目前，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案仍是其主要的治療模式，但在提高患者生存率方面已達(dá)到平臺期[3-4]，在聯(lián)合靶向治療如貝伐單抗、吉非替尼等，其方案顯示出一定的獲益率[5-6]，但也僅僅是針對經(jīng)選擇后的小部分合適患者，因而尋求一種新型有效的化療藥物顯得尤為重要。

中藥治療腫瘤是我國在腫瘤治療上的一大特色，由于中藥的不良反應(yīng)小，對人體損害少，使得中藥抗腫瘤研究備受關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用中藥單藥、復(fù)方或從中提取的有效成分對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡的研究取得了可喜的成果。中醫(yī)藥在中晚期NSCLC治療中具有一定的優(yōu)勢，亦顯示出強(qiáng)大的生命力。目前薈萃分析已證實(shí)適當(dāng)食用富含黃酮類蔬菜可一定程度降低發(fā)生肺癌的風(fēng)險率[7]。已有研究證實(shí)，槲皮素涉及的抗肺癌的作用機(jī)制主要有影響p450及GST基因的表達(dá)[8]，除此之外，與抑制腫瘤細(xì)胞增殖，包括抑制氧自由基釋放[9-10]，細(xì)胞周期阻滯[11]及凋亡[12-13]相關(guān)。

Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，它特異性地表達(dá)于胚胎發(fā)育組織及分化未成熟組織，并在幾乎所有惡性腫瘤組織中出現(xiàn)高表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)（胸腺、胎盤、子宮內(nèi)膜除外），并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[14]。它不僅可以通過結(jié)合活性caspase-3和caspase-7產(chǎn)生直接抑制效應(yīng)，還可通過細(xì)胞周期抑制蛋白p21間接抑制caspase而阻止細(xì)胞凋亡[15]。Survivin與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶CDK4結(jié)合，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，使CDK2/cyclinE激活，Rb磷酸化導(dǎo)致 p21從 p21/CD K4復(fù)合物中釋放出來，p21能與線粒體的caspase-3前體相互作用，從而抑制Fas介導(dǎo)的凋亡。已知Survivin抑制細(xì)胞凋亡的作用是受多種因素調(diào)控的，它的磷酸化與否是決定其活性有無的一個重要因素。Survivin是周期蛋白激酶p34cdc2-cyclin B1的有絲分裂底物，而p34cdc2-cyclin B1是調(diào)控G2/M期的重要蛋白；Survivin的蘇氨酸34磷酸化后與caspase-9結(jié)合并抑制其活性，阻斷由caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)[16]。Falleni等[17]在Ⅰ期NSCLC的手術(shù)切除標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)，有96%（76/80）的標(biāo)本Survivin基因表達(dá)陽性，顯示Survivin基因在肺癌早期診斷中的價值。Karczmarek等[18]在對肺癌的預(yù)后研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌患者中大部分有Survivin的過表達(dá)，生存中值（14個月）明顯低于無過表達(dá)的患者（60個月）。Ikehara等[19]研究發(fā)現(xiàn)：肺癌TNM分期愈晚、組織分化惡性度愈高，Survivin mRNA陽性表達(dá)率也愈高，這表明Survivin基因可能與腫瘤的侵襲性和預(yù)后相關(guān)。

凋亡與抗凋亡之間的平衡在各種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。已證明Survivin在腫瘤細(xì)胞中能夠抑制凋亡并促進(jìn)其有絲分裂，抑制Survivin功能能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，從而為抗腫瘤治療提供了一個新的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制人肺腺癌A-549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且Survivin蛋白的表達(dá)隨著槲皮素的濃度增加而下降，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，從而推測槲皮素抑制肺癌細(xì)胞的凋亡可能是通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。通過轉(zhuǎn)染Survivin反義寡（脫氧）核苷酸后能夠抑制Survivin的表達(dá)并能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，或是通過Survivin基因特異性RNA干擾，可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的體外增殖并誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡[20]。因此，筆者推測，Survivin的表達(dá)可能在槲皮素抑制肺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮了重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能導(dǎo)致人肺腺癌A-549細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，這與Survivin的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格控制只在G2/M期表達(dá)是否有相關(guān)性，是否因?yàn)镚2/M期的阻滯而導(dǎo)致Survivin的低表達(dá)還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4　參考文獻(xiàn)

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

《浙江醫(yī)學(xué)》對計(jì)量單位的要求

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本刊編輯部

收稿日期：（2013-10-08）

作者單位：310002杭州市第一人民醫(yī)院吳山院區(qū)放療科（徐曉、張珂）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（劉進(jìn)）

通信作者：徐曉，E-mail：xuxiao116@sina.com

Quercetin inhibits proliferation and induces apoptosis of human lung cancer A-549 Cells in vitro

XU Xiao,LIU Jin,ZHANG Ke. Department of Radiation,Wushan Campus,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310002,China

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of quercetin on proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line A-549 in vitro.MethodsThe cultured A-549 cells were treated with different concentrations of quercetin,and cell proliferation and apoptosis were detected by MTT and flow cytometry,respectively.The morphological changes of the apoptotic cells were observed by invert microscopy,transmission electron microscopy and Heochst33258 fluorescence staining.The expression of survivin was analyzed by Western blot.ResultsAfter treatment of quercetin for 24 h the proliferation of A-549 cells was inhibited in a dose-dependent manner,and cells were arrested at the G2/M phase.The apoptosis rates of quercetin treatment groups(15, 30,60μmol/L)were(7.24±1.73)%,(12.57±2.72)%and(26.02±1.67)%,respectively,significantly higher than that of control group [(2.67±2.32)%,P＜0.01].Apoptosis or necrosis of A-549 cells were morphologically observed after quercetin treatment for 24h. The expression of survivin protein in quercetin-treated A-549 cells was decreased in a dose-dependent manner.Conclusion Quercetin can inhibit proliferation and induce apoptosis of human lung cancer A-549 cells,which is associated with cell cycle arrest and down-regulation of survivin expression.

【Key words】Lung CancerQuercetinApoptosisSurvivin