大白菜對褐腐病抗性的快速鑒定方法研究

張耀偉， 苗國輝，2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.大慶市薩爾圖區(qū)農(nóng)業(yè)局，大慶 163000）

大白菜對褐腐病抗性的快速鑒定方法研究

張耀偉1， 苗國輝1，2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.大慶市薩爾圖區(qū)農(nóng)業(yè)局，大慶 163000）

摘要為了建立一套大白菜對褐腐病抗性的快速鑒定方法，本研究對菌絲、菌核作為接種物進行了比較，并分析了菌絲濃度、接種苗齡、接種溫度以及接種后空氣濕度對褐腐病發(fā)病的影響。結(jié)果表明：菌餅回接土壤表面為最佳接種方法，菌絲濃度對致病力無影響；最佳接種苗齡為1～2葉期，最佳接種溫度25℃，最佳接種濕度90%～100%；病情指數(shù)調(diào)查均在接種后第7天。

關鍵詞大白菜； 褐腐?。?鑒定方法

褐腐病是大白菜生產(chǎn)中近幾年逐漸發(fā)展起來的病害，在我國云南、華中以及東北地區(qū)均有發(fā)生，且導致大白菜不同程度減產(chǎn)；雖未發(fā)現(xiàn)大面積的暴發(fā)，但此病危害范圍有蔓延擴大趨勢。褐腐病主要危害大白菜的葉柄，導致葉柄腐爛，使大白菜品質(zhì)降低，產(chǎn)量下降；并且在其運輸、銷售、貯藏過程中繼續(xù)發(fā)病。

抗病育種是防治病害的最有效手段，其前提是明確病原菌、建立快速鑒定方法并依此篩選出抗性種質(zhì)。苗國輝［1］、李寶聚［2］等人鑒定大白菜褐腐病病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。立枯絲核菌是一類廣泛存在于自然界中的土壤習居真菌，能引起多種作物病害，在不同作物表現(xiàn)癥狀不同，在辣椒上表現(xiàn)為莖腐和根腐［3］，在白菜上表現(xiàn)為葉腐［4］。張麗對國內(nèi)外有關立枯絲核菌進行歸納梳理，認為到目前為止，立枯絲核菌共劃分為14個融合群、21個融合亞群［5］。苗國輝對采集自天津、黑龍江兩地大白菜褐腐病上的立枯絲核菌，確定分屬立枯絲核菌AG-2融合群和AG-1融合群［1］。

目前，對大白菜褐腐病病原菌已明確，但對大白菜褐腐病抗性鑒定的方法研究還沒有報道。本試驗研究不同接種物、接種方法、接種苗齡、接種溫度、接種濕度等多個因素對苗期活體接種褐腐病病原菌后的大白菜褐腐病發(fā)病的影響。目的是建立大白菜對褐腐病的苗期快速鑒定方法，為篩選抗病種質(zhì)和培育抗褐腐病的大白菜新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院大白菜研究室分離的立枯絲核菌TJ菌株（Rhizoctonia solani Kühn）［1］。

1.2 供試品種

研究接種方法對大白菜褐腐病發(fā)病影響所用9份材料在田間發(fā)病程度有顯著差異，分別為‘CMS109’、‘C30’、‘C34’、‘A77’、‘A54-1’、‘A103-3-1’、‘A161’、‘A28-3’、‘A23-2’。

研究不同接種物、接種苗齡、接種溫度、接種濕度對大白菜褐腐病發(fā)病影響，所用材料為田間發(fā)病較重的‘A54-1’。

以上品種均由東北農(nóng)業(yè)大學大白菜研究室提供。

1.3 試驗方法

大白菜育苗：育苗工作在封閉完好的防蟲PC板溫室內(nèi)進行。所用營養(yǎng)土經(jīng)高溫滅菌，營養(yǎng)缽為8 cm×8 cm。種子充實飽滿，發(fā)芽勢一致，每缽2粒種子，覆土厚度0.7～1 cm，待子葉展平后，留1株。溫度控制在30℃以下、15℃以上，自然光照。

1.3.1 不同接種方法對致病性的影響研究

將分離菌株接種于PDA平板上，在25℃黑暗下恒溫培養(yǎng)5 d，用直徑6 mm的打孔器打取菌餅接種于無菌苗的土壤表面、無傷口無菌苗軟葉和葉柄上，每株接1個菌餅。其接種于無菌苗的土壤表面，苗齡為1～2葉期；接種無菌苗軟葉上，苗齡為3～4葉期。接種無菌苗葉柄，苗齡為7～8葉期。晝∥夜溫度為21℃∥18℃；晝∥夜光照為14 h∥10 h；濕度均是80%。每處理3次重復，每次重復18株。于接種5、7、9 d后進行病情調(diào)查，記載發(fā)病程度。并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，最終確定最適接種方法。

1.3.2 不同接種物對致病性的影響研究

1.3.2.1 菌絲與菌核致病速率的研究

分離菌株接種于PDA平板上，在25℃黑暗下恒溫培養(yǎng)5 d，用于打取菌餅。菌核是在25℃黑暗下恒溫培養(yǎng)13 d，之后選取大小一致的菌核。

將已打好的菌餅和選好的菌核分別接種于苗齡為1～2葉期的無菌苗土壤表面，每株接1個菌餅或3個菌核。晝∥夜溫度為21℃∥18℃；晝∥夜光照為14 h∥10 h；濕度80%。每處理3次重復，每次重復18株。接種5、7 d后，開始觀察發(fā)病情況，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 內(nèi)圍菌餅、外圍菌餅致病性的研究

分離菌株接種于PDA平板上，在25℃黑暗下恒溫培養(yǎng)5 d，用于打取菌餅。分別打取菌落外圍邊緣菌餅和菌落中心的菌餅。

將已準備好的內(nèi)圍菌餅、外圍菌餅分別接種于苗齡為1～2葉期無菌苗土壤表面。晝∥夜溫度為21℃∥18℃；晝∥夜光照為14 h∥10 h；濕度80%。每個處理3次重復，每次重復18株。接種5、7、9 d后進行調(diào)查，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3.3 大白菜對褐腐病抗性鑒定最佳接種苗齡的確定

本試驗采取單因素試驗，設3個水平：苗齡分別為1～2葉期、3～4葉期、5～6葉期，接種方法為1.3.1確定的最佳方法，接種物為1.3.2確定的接種物。晝∥夜溫度為21℃∥18℃；晝∥夜光照為14 h∥10 h；濕度80%。試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，每個處理3次重復，每次重復18株，接種7 d后進行病情調(diào)查。

1.3.4 大白菜對褐腐病抗性鑒定最佳接種溫度的確定

本試驗采取單因素試驗，設3個水平：溫度分別為晝∥夜溫度為29℃∥18℃、25℃∥18℃、21℃∥18℃；濕度為80%。晝∥夜光照為14 h∥10 h。接種苗齡根據(jù)1.3.3試驗結(jié)果確定。試驗在光照培養(yǎng)箱中進行。每個處理3次重復，每次重復18株，接種7 d后進行病情調(diào)查。

1.3.5 大白菜對褐腐病抗性鑒定最佳接種濕度的確定

本試驗采取單因素試驗，設3個水平：相對濕度分別為50%～60%、70%～80%、90%～100%。接種苗齡、溫度分別根據(jù)1.3.3、1.3.4試驗結(jié)果確定。晝∥夜光照為14 h∥10 h。試驗在光照培養(yǎng)箱中進行。每個處理3次重復，每次重復18株，接種7 d后進行病情調(diào)查。

1.3.6 病情調(diào)查

（1）病情分級標準

根據(jù)預備試驗，參照許志剛［6］的方法，確定單株病害分級標準。將單株的發(fā)病情況分為0級、1級、3級、5級、7級、9級。

0級：無病斑；

1級：0 cm＜病斑長度＜1 cm；

3級：1 cm≤病斑長度＜2 cm；

5級：2 cm≤病斑長度＜3 cm；

7級：3 cm≤病斑長度＜4 cm；

9級：腐爛或死亡。

注：接種軟葉發(fā)病、接種土壤發(fā)病均采用上述病情分級標準。

（2）病情指數(shù)計算

病情指數(shù)H＝100×［（各級發(fā)病株數(shù)×病級）／最高發(fā)病級數(shù)×調(diào)查株數(shù)］。

1.3.7 統(tǒng)計分析

單因素方差分析，顯著性測驗采用新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法對致病性的研究

如圖1a所示，將立枯絲核菌菌餅接種于根部土壤，發(fā)病初期下胚軸呈水浸狀，后逐漸向上擴展至整個下胚軸，病部逐漸凹陷、縊縮，灰黑色；濕度大時水浸狀腐爛，濕度小時被侵染部位表皮脫落，癥狀為立枯病病癥。菌餅接種于葉柄，發(fā)病較快且初期為黃色水浸狀病斑，后漸變?yōu)樯詈稚?，最后葉柄腐爛，如圖1b所示。菌柄接種于軟葉，發(fā)病初期為褐色小斑點，后漸變?yōu)樯詈稚酥梁诤稚蟀?，病斑逐漸擴大，濕度大時軟葉腐爛，如圖1c所示。

試驗發(fā)現(xiàn)，將菌餅接種于軟葉、菌餅接種于土壤致病癥狀相對穩(wěn)定，菌餅接種葉柄上，發(fā)病不穩(wěn)定，出現(xiàn)葉柄未被侵染或致病速率不一致，因此確定菌餅回接葉柄的接種方法與其他兩種方法相比較，受外界環(huán)境影響較大，不適合作為鑒定接種方法。

圖1 菌餅接種于‘A54-1’的不同部位發(fā)病癥狀Fig.1 Pathogenic symptom in different parts of‘A54-1’inoculated with the fungus cake

利用菌餅接種于軟葉、菌餅接種于土壤的方法對9個大白菜自交系進行鑒定，結(jié)果見表1。試驗結(jié)果表明，將菌餅接種于土壤表面，接種后5、6、9 d調(diào)查對不同品種病情指數(shù)排列順序影響較小，對不同品種致病性穩(wěn)定。將菌餅接種于軟葉表面，接種后5、7、9 d調(diào)查對不同品種致病性呈現(xiàn)出很大差別，在不同接種天數(shù)內(nèi)，不同品種的病情指數(shù)排列順序相差很大，發(fā)病規(guī)律不一致。因此確定，將菌餅接種于軟葉表面的方法對大白菜苗期抗性鑒定研究不可行，將菌餅接種于土壤的方法是科學的。

表1 菌餅接種于不同品種土壤表面和軟葉表面后發(fā)病一致性分析1）Table 1 Comparison of disease index on different varieties after fungus cake inoculated to the soil and on the leaf

2.2 不同接種物對致病性的影響研究

2.2.1 接種菌餅與菌核發(fā)病速率的研究

由圖2可以看出，在相同條件下，將菌餅接種于土壤先于菌核接種于土壤發(fā)?。唤臃N5 d和接種7 d后，菌餅接種幼苗發(fā)病數(shù)均高于菌核接種的發(fā)病數(shù)，見表2。因此確定菌餅的致病速率快于菌核的致病速率。

圖2 菌餅與菌核接種于土壤表面發(fā)病比較Fig.2 Comparison of pathogenic rate after cake and sclerotium inoculated to the soil

表2 菌餅與菌核接種于土壤表面發(fā)病率比較1）Table 2 Comparison of pathogenic rate after fungus cake and sclerotium inoculated to the soil

2.2.2 內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅致病性分析

由圖3可以得出，在相同條件下內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅接種2 d時均已發(fā)病，且內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅發(fā)病癥狀相同。對接種后5、7、9 d病斑長度調(diào)查，結(jié)果表明內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅兩處理無顯著差異，見表3。

2.3 不同苗齡、溫度、濕度對大白菜褐腐病發(fā)病的影響

2.3.1 不同苗齡對大白菜褐腐病發(fā)病的影響

從表4可以看出，接種苗齡為1～2葉期時病情指數(shù)最大，且與其他兩個接種時期的病情指數(shù)呈極顯著差異，說明苗齡越小越有利于病原菌的侵染，確定大白菜褐腐病的最佳接種苗齡為1～2葉期。

圖3 內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅接種于土壤表面發(fā)病比較Fig.3 Comparison of pathogenic rate after fungus internal and external fungus cakes inoculated to the soil

表3 內(nèi)圍菌餅與外圍菌接種于土壤病斑長度差異分析1）Table 3 Variance analysis of lesion length after internal and external fungus cakes inoculated to the soil

表4 不同接種苗齡發(fā)病病情指數(shù)差異分析Table 4 Disease index at different inoculation seedling stages

2.3.2 不同溫度對大白菜褐腐病發(fā)病的影響

本試驗采用已確定的最佳接種苗齡1～2葉期幼苗。從表5可以看出，接種溫度為25℃∥18℃時病情指數(shù)最大，且與其他兩個接種溫度的病情指數(shù)呈極顯著差異，說明相對于其他兩個接種溫度條件，接種溫度為25℃∥18℃更有利于病原菌的侵染。

表5 不同接種溫度發(fā)病病情指數(shù)差異分析Table 5 Disease index at different inoculation temperatures

2.3.3 不同濕度對大白菜褐腐病發(fā)病的影響

本試驗采用已確定最佳接種苗齡1～2葉期幼苗，溫度為已確定最佳接種溫度25℃∥18℃。從表6可以看出，濕度不同對病原菌侵染幼苗有很大影響，在濕度為90%～100%時病情指數(shù)最大，且與其他兩接種濕度條件下的病情指數(shù)有極顯著差異，由此確定大白菜褐腐病的最佳接種濕度為90%～100%。

表6 不同接種濕度發(fā)病病情指數(shù)差異分析Table 6 Disease index under different inoculation humidity

3 結(jié)論與討論

3.1 接種方法是抗性鑒定方法一個重要因素

對于大白菜苗期褐腐病抗性接種方法的研究尚未有報道，因此選出一種科學的接種方法至關重要。本試驗中將大白菜褐腐病病原菌接種于土壤，幼苗發(fā)病癥狀符合苗期立枯病癥狀，說明大白菜褐腐病病原菌在苗期導致幼苗立枯病發(fā)生，這也與立枯絲核菌在其他作物苗期致病病狀一致［5］。與其他兩種接種方法相比較，菌餅接種于葉柄發(fā)病不穩(wěn)定，說明在相同條件下菌餅接種葉柄受環(huán)境影響較大，這不利于后續(xù)試驗進行。將菌餅接種于土壤表面，10個大白菜自交系在不同接種天數(shù)內(nèi)的發(fā)病程度排序一致，表明采用這種接種方法，發(fā)病受到外界環(huán)境影響小、穩(wěn)定、可行。

3.2 不同接種物對致病性的影響

前人研究表明菌絲和菌核均可以侵染幼苗導致幼苗發(fā)病，但尚未有報道說明菌絲與菌核侵染速率哪個更快、更穩(wěn)定。試驗表明，在相同條件下菌絲侵染幼苗的致病速率更快，可能是菌絲可以直接侵染幼苗，而菌核需要經(jīng)過一段時間的萌發(fā)，待其長出菌絲后侵染有關；菌核萌發(fā)受環(huán)境影響較大，因此菌核接種法發(fā)病不穩(wěn)定。

在培養(yǎng)基中生長的菌絲，從內(nèi)到外的菌絲密度是不同的。本試驗確定內(nèi)圍菌餅與外圍菌餅的致病性無顯著性差異，說明菌絲濃度不會因為菌餅位置不同而產(chǎn)生誤差。

3.3 接種濕度、苗齡和溫度對褐腐病發(fā)病的影響

接種苗齡、濕度和溫度對于任何病害的快速鑒定都是重要因子。本試驗表明，病原菌對不同苗齡幼苗的侵染速率有很大差異，1～2葉期接種發(fā)病程度最重，這與立枯病在苗期發(fā)病相吻合。其原因可能是苗齡越小其幼苗莖的表皮、皮層發(fā)育越不成熟，抵抗病原菌侵染的能力弱，從而易于受病原菌侵染。

本試驗確定最佳接種溫度為25℃∥18℃（晝∥夜），這與立枯絲核菌在25℃時，菌絲生長最快、菌絲層厚度最厚相吻合［1］，并與自然環(huán)境下苗期立枯病發(fā)病的溫度相吻合。本試驗確定接種后濕度控制在90%～100%時，病原菌侵染幼苗的發(fā)病程度最重，說明濕度越大越有利于病原菌的侵染，這與田間成株期發(fā)生褐腐病和苗期發(fā)生立枯病的環(huán)境條件一致。

參考文獻

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［6］ 許志剛.普通植物病理學［M］.第4版.北京：高等教育出版社，2009.

聯(lián)系方式 E-mail：zhyw1271＠126.com

中圖分類號：S 432.21

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.020

收稿日期：2013-06-06

修訂日期：2013-11-18

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD02B01-13）

Methods for rapid identification of Chinese cabbage resistance to brown rot

Zhang Yaowei1， Miao Guohui1，2
（1.College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Agricultural Bureau of District Saertu，Daqing City，Daqing 163000，China）

AbstractIn order to establish a set of methods for rapid identification of Chinese cabbage resistant to brown rot，we compared the hyphae as inoculum with sclerotia，and analyzed the influence of seedling stage，temperature and air humidity on the occurrence of brown rot.The result showed that inoculation of fungus cake to soil surface was the best method，hyphae concentration was irrelevant to the virulence，the optimal inoculated seedling stage was 1－2 leaf，the optimal inoculated temperature was 25℃and the optimal inoculated humidity was 90%－100%，disease index was surveyed at seven days after inoculation.

Key wordsChinese cabbage； brown rot； identification methods