頂空進樣 GC/MS法研究干漆中的揮發(fā)性毒性成分

王少敏， 陸繼偉， 孟 莉， 季 申

（上海市食品藥品檢驗所， 上海201203）

頂空進樣 GC/MS法研究干漆中的揮發(fā)性毒性成分

王少敏， 陸繼偉， 孟 莉， 季 申

（上海市食品藥品檢驗所， 上海201203）

目的 對干漆藥材的揮發(fā)性毒性成分進行研究。 方法 采用頂空進樣氣相質(zhì)譜聯(lián)用 （GC/MS） 技術(shù)對干漆藥材樣品和飲片進行分析，研究其中的揮發(fā)性毒性物質(zhì)。結(jié)果 共鑒定出了二甲苯、三甲基苯、甲基苯甲醛類同分異構(gòu)體和乙酸至庚酸等系列有機酸類化合物等25個毒性成分。 結(jié)論 對炮制后的干漆色譜圖中雖然仍有二甲苯類和甲基苯甲醛類物質(zhì)的色譜峰，但峰強度明顯降低，證明炮制后毒性明顯減弱。

GC/MS 法； 干漆； 揮發(fā)性毒性成分

干漆是漆樹科植物漆樹 Toxicodendron vernicifluum （Stokes） F.A.Barkl.的樹脂生漆經(jīng)加工后的干燥品，有破瘀通經(jīng)、消積殺蟲的功效，主要用于瘀血閉經(jīng)、 癥瘕積聚、 蟲積腹痛等病癥［1］， 現(xiàn)代臨床也有將干漆與其他藥材組成復(fù)方用于治療冠心病 和 癌 癥 輔 助 治 療［2-5］， 干 漆 在 臨 床 應(yīng) 用 愈 來愈多。

干漆有毒，臨床使用前均需對干漆進行燒制以降低 毒 性［6-8］。 目 前 對 生 漆 的 成 分 已 有 較 多 研究［9-11］，主要成分為漆酚、漆酶、 漆樹多糖、 含氮物、樹膠質(zhì)和水分等，但對干漆及炮制后干漆飲片的成分研究較少，僅認為干漆是生漆中的漆酚在蟲漆酶的作用下，在空氣中氧化生成的黑色樹脂狀物質(zhì)［12］， 對干漆毒性成分研究未見報道。

干漆具有強烈漆臭，有較強毒性，且易致人發(fā)生嚴重過敏，炮制后的干漆毒性明顯減弱，僅有輕微臭味，故推測此類有明顯臭味的揮發(fā)性物質(zhì)可能是干漆的毒性成分。 本實驗采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （GC/MS） 對干漆及干漆炮制品中揮發(fā)性的毒性成分物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，以期明確該藥材的毒性成分基礎(chǔ)，并為進一步的質(zhì)量標準和臨床用藥安全控制提供支持。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司 Agilent6890NGC/5973N MSD氣 相 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 色 譜 儀； MSD Chemistation D 03.00.611 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯等標準物質(zhì)均購自上?；瘜W(xué)試劑研究所，色譜標準。

干漆及相應(yīng)批號的炮制品 （批號為1994090205、1998070603、 1999060208、 1999100512） 由上海華宇藥業(yè)有限公司提供，并由上海中醫(yī)藥大學(xué)崔亞君副教授鑒定。

2 對照品和供試品的制備

2.1 對照品的制備 精密量取乙苯、 對二甲苯、鄰二甲苯和間二甲苯對照品各5 μL， 分別置20mL頂空進樣瓶中，密封，即得。

2.2 供試品的制備 取干漆粉末 （過二號篩） 約0.5 g， 精密稱定， 置 20 m L頂空進樣瓶中， 密封，即得。

3 色質(zhì)聯(lián)用條件

Agilent FFAP毛細管色譜柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 升溫程序為初始溫度 50 ℃， 保持2 min， 以 5 ℃ /min 的 速率升溫至 250 ℃ 并 保 持3 min； 載氣為氦氣， 體積流量 1.0 mL/min； 頂空進樣； 進樣口溫度 280 ℃； 氣質(zhì)接口溫度 250 ℃；電離方式為電子轟擊 （EI）； 電離能量 70 eV； 掃描質(zhì)量范圍 30 ～500 AMU； 掃描間隔 0.5 s。

4 測定法

取對照品和供試品頂空進樣瓶中在110 ℃加熱15 min； 頂空進樣注入氣相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀， 測定，即得。

5 結(jié)果

5.1 揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)構(gòu)確認 對 4 批干漆樣品進行檢測，結(jié)果4批干漆樣品得到的總離子流圖相似，檢出色譜峰個數(shù)一致，僅離子流強度有所不同?？鄢鄳?yīng)的隨行空白中的干擾峰，共檢出 25 個色譜峰， 見圖 1。 對此 25 個峰進行質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖， 經(jīng)與 Nist數(shù)據(jù)庫， 此 25 個峰全部得到鑒定，包括：乙苯和二甲苯等6個同分異構(gòu)體、苯乙酮和甲基苯甲醛等4個同分異構(gòu)體，三甲基苯類3個同分異構(gòu)體、丙基甲苯類4個同分異構(gòu)體、乙酸至庚酸等 6 個有機酸類化合物、萘及 α-甲基苯甲醇，見表1。

圖1 干漆藥材總離子流圖Fig.1 GC/MS ion chromatograms of Toxicodendri Resina

其中質(zhì)譜峰編號分別為3、 4、 5、12、 13 對應(yīng)的化合物為同分異構(gòu)體， 分子式均為 C8H10， 質(zhì)譜圖顯示其應(yīng)為鄰二甲苯、對二甲苯、間二甲苯或其立體異構(gòu)體質(zhì)譜圖， 見圖 2。 為進一步確認峰歸屬，采用鄰二甲苯、對二甲苯、間二甲苯對照品分別進樣，經(jīng)過保留時間確定3、 4、 5 號峰分別為對二甲苯、 間二甲苯、 鄰二甲苯， 12、 13 號峰分別為間二甲苯和鄰二甲苯的立體異構(gòu)體。

表1 干漆藥材揮發(fā)性毒性成分Tab.1 Volatile toxic com pounds in Toxicodendri Resina

續(xù)表1

圖 2 二甲苯類同分異構(gòu)體的 GC/MS質(zhì)譜裂片圖 （化合物 2、 3、 4、 12、 13）Fig.2 GC/MS fractu re ion ch romatogram of structural isomers of Xylene（ com pound 2、 3、 4、 12、13）

5.2 干漆毒性成分確認 4 批干漆藥材的氣質(zhì)聯(lián)用總離子流圖中二甲苯類物質(zhì)色譜峰離子流強度最大，其次為甲基苯甲醛類物質(zhì)，兩類物質(zhì)相對含有量大于 90%。 對炮制后的干漆樣品進行檢測， 并與干漆藥材的氣質(zhì)聯(lián)用總離子流圖進行比對，結(jié)果炮制后的干漆得到的總離子流圖中色譜峰明顯減少，色譜峰的離子流強度也明顯減弱，僅有二甲苯類物質(zhì)和甲基苯甲醛類物質(zhì)較為明顯，其余物質(zhì)的色譜峰基本消失， 見圖1B。

質(zhì)譜解析研究表明，干漆藥材的揮發(fā)性成分主要包括有二甲苯類、三甲基苯類、苯乙酮、丙基甲苯類、甲基苯甲醛類等多種苯環(huán)上氫被烷基取代的衍生物和有機酸類化合物。根據(jù)文獻報道，這些物質(zhì)對人體均有一定的毒性危害，對眼、黏膜和上呼吸道、皮膚有刺激性，接觸后可引起頭痛、頭暈、惡心、麻醉等，及引起中樞神經(jīng)和肝腎等多器官損傷，重者可有躁動、抽搐或昏迷，有的有癔病樣發(fā)作。其中二甲苯類物質(zhì)長期吸入還能導(dǎo)致再生障礙性貧血，并出現(xiàn)神經(jīng)衰弱樣癥狀，導(dǎo)致胎兒的先天性缺陷［13-14］。 由于炮制后的干漆飲片與干漆藥材相比，毒性下降，故這些揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)是干漆藥材的重要毒性成分。炮制后的干漆色譜圖中雖然仍有二甲苯類和甲基苯甲醛類物質(zhì)的色譜峰，但峰強度明顯降低，證明了干漆經(jīng)過炮制后毒性明顯減弱。

6 討論

6.1 曾用有機溶劑對干漆藥材進行提取， 以溶液法進樣，以獲得非揮發(fā)性和揮發(fā)性毒性成分的全面信息。先后考察了乙醇、甲苯、正己烷、乙酸乙酯等溶劑，但在實驗中發(fā)現(xiàn)供試品溶液不穩(wěn)定，隨著光照和加熱，溶液顏色變深，供試品溶液色譜圖無法重現(xiàn)?？紤]到干漆藥材本身為干透后的樹脂，其較為黏厚的特殊結(jié)構(gòu)使得藥材的外表面可能阻斷了外界空氣中氧氣對內(nèi)部物質(zhì)的氧化，而將其溶解在溶劑中后可能增加了氧化的速度，致使供試品溶液極為不穩(wěn)定。采用頂空進樣法，經(jīng)過反復(fù)試驗，結(jié)果可以得到重復(fù)、穩(wěn)定的供試品色譜圖，故最終選擇了頂空進樣法。

6.2 考察了 DB-5、 DB-17、INNOWAX和 FFAP 4種不同極性范圍的毛細管氣相色譜柱， 結(jié)果 DB-5和 DB-17 色譜柱得到的供試品色譜圖中僅有 2 ～3個色譜峰，而 INNOWAX和 FFAP得到的供試品溶液的色譜峰較多， 顯示較多信息，且 FFAP色譜柱得到的色譜峰分離度最好， 故選擇 FFAP色譜柱作為研究用色譜柱。

6.3 對升溫程序進行了優(yōu)化： ① 起始 50 ℃，10 ℃ /min升至 220 ℃， 保持 3 min；②起始 50 ℃，5 ℃ /min 升至 120 ℃； ③起始 50 ℃， 3 ℃ /min 升至80 ℃， 10 ℃ /min 升 至 200 ℃， 保 持 5 min，20 ℃ /min升至 250 ℃， 保持 5min； ④起始 50℃， 3℃ /min 升 至 60 ℃，保 持 5 min， 15 ℃ /min 升 至120 ℃， 保持 5 min； 20 ℃ /min 升至 250 ℃， 保持3 min； ⑤起始 50 ℃， 保持 2 min， 5 ℃ /min 升至250 ℃，保持3 min。 結(jié)果表明升溫程序⑤的條件下達到最好的分離度。

6.4 考察了 0.2 g、 0.5 g、 1.0 g 3 種取樣量， 結(jié)果取樣 0.2 g得到的供試品色譜峰數(shù)目較少， 而取樣0.5 g和 1.0 g得到的供試品色譜峰數(shù)目明顯增加， 且基本一致， 因取樣量為 1.0 g時，色譜峰變寬， 影響分離度， 故確定取樣量為 0.5 g。

6.5 考察了 80 ℃、 110 ℃、 135 ℃、 165 ℃ 4 種頂空瓶加熱溫度， 結(jié)果80℃加熱后得到的供試品色譜峰數(shù)目明顯較少， 而110 ℃、135 ℃、165 ℃3 種溫度得到的供試品色譜峰數(shù)目與色譜峰強度基本一致。 將頂空瓶加熱溫度設(shè)定為 110 ℃， 考察 10 min、15 min 和 25 min 3 種 不同加熱時 間，結(jié)果加熱 10 min 得到的供試品色譜峰數(shù)目較少，色譜峰強度較低， 而加熱 15 min 和 25 min 得到的數(shù)目供試品溶液中色譜峰數(shù)目和色譜峰強度基本一致。故確定頂空瓶加熱方式為：110 ℃加熱 15 min。

6.6 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具備分析速度快、 高靈敏度、全譜記錄、譜庫數(shù)據(jù)全等特點，可以提供準確的質(zhì)量數(shù)、碎片信息和可能結(jié)構(gòu)，對于未知化合物的鑒定是強有力的工具。本實驗采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過比較干漆藥材和炮制后的干漆飲片離子流圖中的色譜峰個數(shù)和強度，對干漆有毒揮發(fā)性成分進行了確認，并利用對照品和氣質(zhì)譜庫對化合物進行了準確的定性，首次對干漆的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)進行了研究，也為其他藥材毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了一種思路。

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Volatile toxic constituents of Toxicodendri Resina by headspace GC/MS

WANG Shao-min， LU Ji-wei， MENG Li， JIShen
（Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203， China）

AIM To study the violatile toxic constituents in Toxicodendri Resina.METHODS The headspace GC/MS technique was applied to isolating volatile toxic constituents in Toxicodendri Resina and its decoction pieces.RESULTS Twenty-five volatile compounds from Toxicodendri Resina were isolated and identified including structural isomers of xylene， trimethyl-benzene，methyl-benzaldehyde and serious organic acids.CONCLUSION Processed ToxicodendriResina remains fingerprint peaks of xylene andmethyl-benzaldehyde， but their intensity decreases， which showes the processing can markedly attenuate the toxicity of Toxicodendri Resina

GC/MS； Toxicodendri Resina； volatile toxic constituents

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0567-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.026

2013-05-06

王少 敏 （ 1978—）， 女， 碩 士， 主 管 藥 師， 主 要 從 事 中 藥 質(zhì) 量 控 制 研 究。 Tel： （ 021 ） 38839900-26107， E-mail： wangshaomin2008@163.com