牛黃及安宮牛黃丸中游離膽紅素的 RP-HPLC測定方法改進

曹 帥， 夏 晶， 鐘吉強， 季 申

（上海市食品藥品檢驗所， 上海 201203）

牛黃及安宮牛黃丸中游離膽紅素的 RP-HPLC測定方法改進

曹 帥， 夏 晶， 鐘吉強， 季 申*

（上海市食品藥品檢驗所， 上海 201203）

目的 改進 RP-HPLC法測定牛黃及安宮牛黃丸中的游離膽紅素以保證牛黃類藥材及安宮牛黃丸的質(zhì)量與用藥安全。 方法 以二氯甲烷為溶劑提取樣品， HPLC法測定游離膽紅素的量。 對于安宮牛黃丸， 分別考察碳酸鈣、硅藻土等不同分散介質(zhì)對游離膽紅素測定的 影響。 色譜條件為 Kromasil 100?C18色 譜柱 （ 5 μm， 0.46 cm×15 cm） ， 以乙腈-1%冰醋酸 （95 ∶5） 為流動相， 檢測波長為 450 nm。 結(jié)果 膽紅素在 0.305 5 ～30.55 μg/m L范圍內(nèi)線性良好， 加樣回收率在 95% ～105%之間。 對于安宮牛黃丸， 采用碳酸鈣作為分散介質(zhì)的測定結(jié)果優(yōu)于硅藻土等介質(zhì)。結(jié)論 采用碳酸鈣替代硅藻土作為牛黃類藥材及其大蜜丸樣品中游離膽紅素分析的分散介質(zhì)，方法準確度高，操作簡便易行。

牛黃；安宮牛黃丸；游離膽紅素；碳酸鈣

牛黃是傳統(tǒng)的名貴中藥材，因藥源稀缺，陸續(xù)出現(xiàn)了人工牛黃、培植牛黃和體外培育牛黃3種代用品［1］。 牛 黃 類藥材及其 中 成藥臨床應(yīng) 用 廣 泛，其中有38個品種及同系列品種， 國家明令禁止使用人工牛黃投料［2］， 主要原因為人工牛黃與其他 3種牛黃有本質(zhì)的區(qū)別：人工牛黃中僅含游離膽紅素，而其他3種牛黃中主要含結(jié)合膽紅素和共價膽紅素，游離膽紅素為限量成分。游離膽紅素脂溶性強，可穿過人體的血腦屏障，具有神經(jīng)毒性，其在牛黃類藥材及制劑中含有量過高會對人體產(chǎn)生直接的毒副作用［3-4］， 因此需 建立牛黃類藥材及 其制劑中游離膽紅素的定量測定方法，對其含有量范圍進行監(jiān)測控制， 保證臨床用藥的安全［5］。

牛黃及其代用品收載于歷年 《中國藥典》 及增補本中，除人工牛黃外，其余牛黃均采用紫外-可見分光光度法檢查游離膽紅素的含有量限量［6］，由于該法測定的是膽紅素四吡咯環(huán)母核結(jié)構(gòu)，在制劑中應(yīng)用易受其他藥味干擾。目前文獻報道的游離膽紅素測定多集中 于牛黃類藥材［7-8］， 制劑 中報道較少，由于制劑中無較好的方法控制游離膽紅素的量，導致牛黃類制劑中存在游離膽紅素代替牛黃類藥材投料的現(xiàn)象，易造成該類藥物的安全隱患。本研究鑒于此種現(xiàn)象建立牛黃類藥材及安宮牛黃丸中游離膽紅素的 HPLC定量測定方法。

本次研究除培植牛黃因市場上少見未能收集到樣品外，其余3種牛黃均建立了方法。安宮牛黃丸是臨床上常用的含牛黃制劑，因此一并建立了其游離膽紅素的定量測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、 試劑與材料

1.1.1 儀器 Agilent1100 液相色譜儀 （ 美國 Agilent公司）； 超聲波清洗儀 （上海科導超聲儀器有限公司 SK8210LHC）； 離心機 （Eppendorf5430R）；旋渦混合器 （IKA MS2）。

1.1.2 試劑 膽紅素對照品 （中國藥品生物制品檢定所提 供， 批號 10077-200503 ）； 乙腈 為色譜純，二氯甲烷、碳酸鈣等其余試劑均為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司。

樣品收集情況見表1。

表1 樣品收集情況Tab.1 Sample list

1.2 色譜條件 Kromasil 100?C18色譜柱 （5 μm，0.46 cm ×15 cm） ； 流 動 相 為 乙 腈-1% 冰 醋 酸（95 ∶5） 等度洗脫； 檢測波長 450 nm； 柱溫 30℃； 體積流量 1.0 mL/min； 進樣量 5 μL。

1.3 樣品處理與溶液制備

1.3.1 牛黃類藥材

1.3.1.1 對照品溶液的制備 取膽紅素對照品適量， 精密稱定， 加二氯甲烷制成每 1 mL各含 10 μg、5 μg、3 μg的溶液， 分別用于人工牛黃、 體外培育牛黃、天然牛黃中游離膽紅素的定量測定。

1.3.1.2 供試品溶液的制備 分別取牛黃類藥材適量， 研成極細粉， 取約 20 mg， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中，渦旋混勻，精密加入水飽和二氯甲烷10 mL， 稱定質(zhì)量， 渦旋混勻， 置冰浴中超聲處理（功率 500 W， 頻率 53 kHz） 30 min， 再稱定質(zhì)量，用水飽和二氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取二氯甲烷液， 用微孔濾膜 （0.22 μm） 濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 安宮牛黃丸

1.3.2.1 對照品溶液的制備 取膽紅素對照品適量， 精密稱定， 加二氯甲烷制成每 1 mL含1～3 μg的溶液，用于含牛黃類中成藥中游離膽紅素的測定。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 取安宮牛黃丸樣品適量，加入適量的無水碳酸鈣，混合均勻后充分研磨， 取樣品粉末60 mg，精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入二氯甲烷 20 mL， 稱定質(zhì)量， 渦旋混勻， 冰浴中超聲處理 （功率 500 W， 頻率 53 kHz）30 min，再稱定質(zhì)量，用二氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取二氯甲烷液，用微孔濾膜（0.22 μm） 濾過， 取續(xù)濾液， 即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 影響游離膽紅素測定的關(guān)鍵因素分析 人工牛黃中的膽紅素僅為游離膽紅素，除人工牛黃外，其他3種牛黃中的膽紅素有游離膽紅素、膽紅素鈣、膽紅素酯、膽紅素蛋白聚合物等多種存在形式［9］。若要準確測定樣品中的游離膽紅素，需保證在樣品前處理及測定過程中膽紅素鈣、酯等分解成游離膽紅素。另外，由于游離膽紅素不穩(wěn)定，易被氧化，測定中應(yīng)注意避光操作，避免引入破壞氧化游離膽紅素分子的因素。

2.1.2 安宮牛黃丸樣品分散介質(zhì)的考察 牛黃類藥材質(zhì)輕，松脆，易研磨成粉，樣品取樣相對容易。安宮牛黃丸為大蜜丸，含大量煉蜜，其存在會影響樣品準確取樣，因此測定前需對樣品進行研磨分散。理想的分散介質(zhì)應(yīng)能夠通過研磨等方式將樣品分散均勻，且不會導致膽紅素鈣、酯等分解成游離膽紅素，同時不破壞游離膽紅素的結(jié)構(gòu)。

硅藻土為常用的蜜丸分散劑， β-環(huán)糊精也有文獻報道［10］， 考慮到牛黃中的膽紅素多與鈣離子結(jié)合，本研究選取了灰色硅藻土、白色硅藻土、β-環(huán)糊精、 碳酸鈣 4 種分散介質(zhì)， 分別考察其游離膽紅素的測得量，并加入適量的膽紅素對照品溶液，考察各樣品游離膽紅素的加樣回收率，結(jié)果見表2。

表 2 不同分散介質(zhì)的回收率 （n=6）Tab.2 Recovery of differen t dispersion medium（ n=6）

結(jié)果表明，硅藻土為分散介質(zhì)的回收率偏高，β-環(huán)糊精偏低， 加 CaCO3研磨測得的游離膽紅素含有量較低且回收率較好。分析其原因為，硅藻土為一種生物成因的硅質(zhì)沉積巖［11］， 其中成分復雜，以非晶質(zhì)二氧化硅為主， 但含有 Al2O3、 P2O5、 有機質(zhì)等雜質(zhì)，且雜質(zhì)越多，顏色越深。硅藻土中的復雜成分可能會將部分結(jié)合或共價膽紅素分解轉(zhuǎn)變成游離膽紅素［12］， 導致測得量增加。 另外硅藻土中的復雜成分增加了試驗中的不可控因素，導致回收率試驗 RSD結(jié)果偏高。 β-環(huán)糊精與樣品研磨分散較好，但其回收率試驗結(jié)果偏低，分析其可能的原因如下： β-環(huán)糊精中含有的多羥基結(jié)構(gòu)可能會與游離膽紅素中的羧酸基團形成分子間氫鍵［13］， 破壞了能保持游離膽紅素自身穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵結(jié)構(gòu)［14］（ 分子內(nèi)氫鍵結(jié)構(gòu)見圖 1 ） ， 使其穩(wěn) 定性降低，加劇了游離膽紅素的分解，導致回收率偏低，具體的作用機制有待于進一步探索研究。

試驗用 CaCO3為分析純， 含雜質(zhì)較少，與樣品研磨分散性好，鈣離子為牛黃中本身含有的離子，酸性 較 弱 不 足 以 使 結(jié) 合或 共 價 膽紅 素 分解。碳酸鈣在二氯甲烷中性質(zhì)穩(wěn)定，試驗回收率較好，是理想的樣品分散介質(zhì)。

圖1 游離膽紅素分子內(nèi)氫鍵Fig.1 Intramolecular hydrogen bonding of bilirubin

2.2 方法驗證參數(shù)

2.2.1 專屬性試驗 供試品色譜中， 均具與膽紅素對照品保留時間一致的色譜峰，無其他成分干擾。安宮牛黃丸等中成藥空白樣品 （缺牛黃） 在膽紅素對照品保留時間處無色譜峰，無干擾，見圖2。

圖2 專屬性試驗Tab.2 Specificity tests

2.2.2 線性范圍 精密稱取膽紅素對照品適量，加二氯甲烷配制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液液。取系列質(zhì)量濃度的對照品溶液各 5 μL， 注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明， 在 0.305 5 ～30.55 μg/mL范圍內(nèi)， 膽紅素對照品溶液的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為 0.999 7。

2.2.3 加樣回收率試驗 分別取牛黃類藥材， 精密加入適量膽紅素對照品，按供試品溶液的制備方法制備和測定。對于安宮牛黃丸中游離膽紅素的回收率試驗，取不含牛黃類藥材的空白樣品，精密加入適量膽紅素對照品 （對照品加入量分別為樣品含有量的 80%，100%， 120%）， 按供試品溶液的制備方法制備和測定， 結(jié)果見表 3， 回收率為95% ～105%，RSD為 1% ～4%。

表 3 加樣回收率試驗 （n=9）Tab.3 Results of recovery tests（n=9）

2.2.4 重復性試驗 分別取 3 種牛黃藥材及安宮牛黃丸，按供試品溶液的制備方法制備和測定，分低、中、高3個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度制備3份供試品溶液進行測定， 結(jié)果見表4。

表4 重復性試驗Tab.4 Results of precision tests

2.3 實際樣品的測定

2.3.1 樣品測定結(jié)果 對收集到的樣品分別按正文供試品溶液的制備方法制備和測定，結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果Tab.5 Results of sample tests

2.3.2 結(jié)果分析與討論

2.3.2.1 牛黃類藥材中游離膽紅素含有量限值的確定 《中國藥典》 2010 年版一部 “牛黃”、 “體外培育牛黃”質(zhì)量標準中均制訂了游離膽紅素的檢查項［6］， 將 10 mg牛黃或體外培育牛黃溶于 50 m L或5 m L三氯甲烷中， 紫外-可見分光光度法453 nm下測得的吸光度值不得過 0.70。 本實驗參考上述檢查方法，通過實驗配制系列質(zhì)量濃度的膽紅素對照品溶液，采用紫外分光光度法測定溶液的吸光度，根據(jù)溶液的質(zhì)量濃度及吸光度值繪制相應(yīng)的標準曲線， 計算吸光度為 0.70 時的膽紅素溶液質(zhì)量濃度為 6.865 μg/m L， 以此計算牛黃、 體外培育牛黃中 游 離 膽 紅 素 的 限 量 值 分 別 為 3.43% 和0.343%。 樣品的測定結(jié)果顯示， 體外培育牛黃及天然牛黃樣品中游離膽紅素的含有量在 0.168% ～0.867%， 符合藥典規(guī)定的要求。

2.3.2.2 安宮牛黃丸中游離膽紅素含有量限值的確定 由于體外培育牛黃的生產(chǎn)周期 （1～2周）遠遠短于天然牛黃，其中膽紅素與其他物質(zhì)成分結(jié)合的緊密程度也較天然牛黃?。?5］， 因此在制劑中，受處方中其他藥味的影響，含體外培育牛黃的中藥制劑中游離膽紅素量可能并不低于同品種的含天然牛黃制劑。由于體外培育牛黃為天然牛黃的替代使用品，其質(zhì)量趨近于天然牛黃，故參考天然牛黃，在含牛黃中藥制劑中將膽紅素的限量值確定為3.43%。 安宮牛黃丸的處方為 1 000 g生藥粉，制成 600 丸 （丸重為3 g/粒）， 每 1 000 g生藥粉含牛黃 100 g， 以游離膽紅素含有量不超過 3.43%計算，安宮牛黃丸每丸含游離膽紅素含有量不得超過5.72 mg。 考慮到樣品中有其他藥味配伍，可能會加速牛黃中部分結(jié)合膽紅素分解成游離膽紅素，因此限度放寬到該限度的 115%， 即為不得過 6.58 mg。 樣品的測定結(jié)果顯示， 安宮牛黃丸中游離膽紅素的量均未超過限值。

3 結(jié)論

本研究建立了牛黃類藥材及安宮牛黃丸中游離膽紅素的定量測定方法，創(chuàng)新性地選取無水碳酸鈣為大蜜丸的分散介質(zhì)，克服了傳統(tǒng)分散介質(zhì)硅藻土對游離膽紅素測定的影響，準確測定了樣品中游離膽紅素的量。

本研究參考 《中國藥典》 對牛黃類藥材游離膽紅素的限量規(guī)定，推算了安宮牛黃丸中游離膽紅素的含有量限量，可用于安宮牛黃丸中非法摻加游離膽紅素或直接以游離膽紅素替代牛黃投料的檢測。另外，研究改進了不同牛黃中游離膽紅素的測定方法，統(tǒng)一了牛黃原料與制劑的方法，使結(jié)果更準確，藥品質(zhì)量更可控。

該方法操作簡便易行，通用性較強，可為其他含牛黃類中成藥中游離膽紅素的測定提供借鑒參考。

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Im provem ent of unconjugated bilirubin in bezoar and Angong Niuhuang Pills by RP-HPLC

CAO Shuai， XIA Jing， ZHONG Ji-qiang， JIShen*
（Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203， China）

AIM To use RP-HPLCmodification to improve themethod for unconjugated bilirubin determination in bezoar and Angong Niuhuang Pills in order to assure their quality and safety.METHODS Unconjugated bilirubin in bezoar and Angong Niuhuang Pills was eluted on a Kromasil C18column （5 μm， 0.46 cm×15 cm）by an ioscraticmobile phase composed of acetonitrile-1%acetic acid （95 ∶5） and detected at450 nm.For Angong Niuhuang Pills， different kinds of dispersion medium such as CaCO3， diatomite were investigated.RESULTS Unconjugated bilirubin was well detected in samples and its linear range was 0.305 5-30.55 μg/mL with average recoveries of 95%-105%.CONCLUSION The experiment shows thatmethod of CaCO3replacing diatomite as dispersion medium in honey bolus is easy to determine the contests of unconjugated bilirub in bezoar and Angong Niuhuang Pillswith high accuracy.

bezoar； Angong Niuhuang Pills； unconjugated bilirubin； CaCO3

R927.2， R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0536-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.019

2013-05-02

上海市科委資助項目 （12ZR1428100）

曹 帥， 碩士。 Tel： （021） 38839900， E-mail： cslucky2009@gmail.com

*通信作者： 季 申， 博士， 主任藥師。 Tel： （021） 50798195