葛根素聯(lián)用氯沙坦對腎性高血壓大鼠心肌 MMP-1/TIMP-1 比值的影響

黃幀檜， 陳 莉， 柏 松， 汪江濤， 丁伯平

（皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級實驗室，安徽 蕪湖 241002）

葛根素聯(lián)用氯沙坦對腎性高血壓大鼠心肌 MMP-1/TIMP-1 比值的影響

黃幀檜， 陳 莉， 柏 松， 汪江濤， 丁伯平

（皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級實驗室，安徽 蕪湖 241002）

目的 觀察葛根素聯(lián)用氯沙坦對腎性高血壓大鼠心肌 MMP-1/TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)比值的影響。 方法 SD大鼠65只， 雄性， 隨機抽取8只為假手術(shù)組， 其余采用兩腎一夾法造成腎性高血壓大鼠模型。 造模成功的大鼠隨機分成葛根素高、 中、 低劑量組， 氯沙坦組， 聯(lián)用組以及模型組 （n=8）。 連續(xù)給藥 8 周后計算左心室質(zhì)量指數(shù)（LVWI）， Masson 染色觀察膠原纖維改變， 并計算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)； 測心肌羥脯氨酸 （HYP）、 血管緊張素Ⅱ （AngⅡ） 水平， RT-PCR及 Western blot測心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-1 （ MMP-1） 及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 （ TIMP-1） mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與模型組相比， 各用藥組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、 HYP水平降低 （P＜0.01 或 P＜0.05）， 聯(lián)用組效果最好 （P＜0.05）； 葛根素高、 中劑量組和聯(lián)用組心肌 AngⅡ水平顯著降低 （P＜0.01 或 P＜0.05）， 聯(lián)用組效果最好 （ P＜0.05）； 除葛根素低劑量組外其他用藥 LVW I顯著降低 （ P＜0.01 或 P＜0.05） ， MMP-1 與 TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)的比值顯著降低 （P＜0.05）， 聯(lián)用組效果最好 （P＜0.05）。 結(jié)論 葛根素聯(lián)用氯沙坦能顯著下調(diào)心肌局部MMP-1/TIMP-1mRNA及蛋白比值， 改善腎性高血壓大鼠心肌纖維化。

腎性高血壓大鼠； 葛根素聯(lián)用氯沙坦； 心肌纖維化； MMP-1/TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)比值

高血壓患者中有三分之一會并發(fā)高血壓性左室重構(gòu)，其被認(rèn)為是加重冠心病、充血性心力衰竭等心血管疾病的獨立危險因素。治療高血壓不應(yīng)僅局限于降壓，更重要的是防止和減少心臟并發(fā)癥。傳統(tǒng)的西藥降壓藥，降壓雖較快捷，但可出現(xiàn)諸多方面的不良反應(yīng)， 如血管緊張素Ⅱ （AngⅡ） 受體 1型 （AT1R） 抑制劑可通過抑制 AngⅡ與其 AT1R結(jié)合降低血壓，逆轉(zhuǎn)高血壓靶器官重構(gòu)，但長期應(yīng)用會出現(xiàn) AngⅡ升高， 引起不良反應(yīng)。

葛根素 （ puerarin） 是從中藥葛根中分離出的一種異黃酮類化合物，具有降低血壓、減慢心率，擴張冠狀動脈、改善心肌缺血再灌注引起的心功能損害［1］等作用。 研究發(fā)現(xiàn)葛根素可改善異丙腎上腺素所致的小鼠心肌纖維化，減少心肌膠原沉積［2］。本課題組前期研究也證實其能夠逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠的左室肥厚［3］。 氯沙坦是第 1 個用于臨床的 AT1R抑制劑， 能在受體水平上阻斷 AngⅡ的作用， 逆轉(zhuǎn)高血壓心肌重構(gòu)。 黃成晉等［4］的研究發(fā)現(xiàn)葛根素聯(lián)用氯沙坦在治療高血壓的同時，能夠逆轉(zhuǎn)左室肥厚，且二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳，但具體機制并不清楚。 MMPs是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類。 金屬蛋白酶-1 （MMP-1） 的主要底物是Ⅰ型、Ⅲ型膠原。在心臟中，Ⅰ型和Ⅲ型膠原約占總膠原的 90%以上， 是構(gòu)成心肌間質(zhì)的主要成分。本研究以兩腎一夾高血壓大鼠為模型，選擇與心肌 膠 原 降 解 密 切 相 關(guān) 的 MMP-1 及 其 抑 制 物TIMP-1 為主要研究對象， 旨在探討葛根素聯(lián)用氯沙坦對腎性高血壓大鼠心肌局部兩者 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動物 65 只雄性 SD大鼠，體質(zhì)量 160 ～180 g， 南京青龍山動物實驗中心提供， 許可證號碼：SCXK （滬） 2008-0016，SPF級。 分籠飼養(yǎng)， 每籠1 只， 保持溫度 22 ～24 ℃， 相對濕度60% ～65%，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥品與試劑 戊巴比妥鈉， 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為 WS20051129； 葛根素注射液，山東方明藥業(yè)股份有限公司，批號為 H20033292；氯沙坦，商品名緩寧，揚子江藥業(yè)股份有限公司，批號為 11050502； MASSON染色試劑盒， 南京建成生物工程研究所， 批號為 20120327； AngⅡ放免試劑盒，北京北方生物科技研究所，批號為120220； 羥脯氨酸 （HYP） 試劑盒， 南京建成生物工程研究所， 批號為 20120224。 以下試劑均為天根 生 化 科 技 （北京） 有 限 公 司 產(chǎn) 品：TRNzol-A+， 批號為#J9117； Oligo（dt）， 批號為 L0301；PCR master mix， 批 號 為 L0228； RNase-free ddH2O， 批號為 L0517； Super pure dNTP， 批號為L0314；Script RT kit， 批號為 L0228； TIAN Script M-MLV， 批號為 ER104-03。 以下試劑均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品：哺乳動物總蛋白提取試劑， 批號為 07E07A01； 蛋白酶抑制劑， 批號為07E07A23； Commassie改良增強蛋白定量試劑盒，批號 為 07B27C45； SDS-PAGE蛋 白 上 樣 緩 沖 液2 ×， 批號為 07B27C31； 硝酸纖維素薄膜， 批號為07B09A35-04； Marker， 批 號 為 07D18814； WB專用 DAB顯色，批號為 06G15B21； 二抗羊抗兔 lgGHRP， 批號為 ST11G12H11H11F；MMP-1 一抗 原液， 批號為 Y-B3-02G30C； TIMP-1 一抗原 液， 批號為97101。

1.3 儀器 ALC-NIBP無創(chuàng)尾動脈血壓測定系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）； 電泳儀 （BGPower 600i， Baygene Biotech Co.LTD.） ； 水平搖床（ZD-9556， 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）； 高速低溫離心機 22R （Beckman Coulter）。

1.4 實驗方案

1.4.1 實驗動物分組與標(biāo)本收集 隨機選取 8 只為假手術(shù)組， 其余 57 只造兩腎一夾模型， 以 3%戊巴比妥鈉 （30 mg/kg） 麻醉動物， 分離左腎動脈、 放置內(nèi)徑為 0.2 mm的銀夾并打結(jié)固定。 假手術(shù)組操作方法同上，但不放置銀夾。術(shù)后4周收縮壓≥160 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa） 者為造模成功［5］。 術(shù)后有 48 只入選腎性高血壓大鼠組。 將造模成功大鼠隨機分為6組，葛根素給藥劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果［6］， 氯沙坦給藥劑量根據(jù)臨床等效劑量，其中聯(lián)用組劑量根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果：葛根素高、中、 低［100、 50、 25 mg/（kg·d）， 腹腔注 射， n =8］ 劑 量 組， 氯 沙 坦 組 ［30 mg/（kg·d）， 0.5%羧甲基纖維素灌胃， n=8］，聯(lián)用組［葛根素 25 mg/（kg·d）， 腹腔注射 +氯沙坦 15 mg/（kg·d），0.5%羧甲基纖維素， n=8］以及模型組 （給予生理鹽水）。 術(shù)后第 5 周開始給藥，連續(xù)給藥8周。8周后，所有實驗動物在深度麻醉下 （3%戊巴比妥鈉， 150 mg/kg）， 腹主動脈取血后，迅速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干， 準(zhǔn) 確 稱 取 全 心 濕 質(zhì) 量 （ heart wet weight，HWW）， 去除血管殘根、 心房、 右室游離壁， 保留室間隔及左心室， 稱量左心室濕質(zhì)量 （ left ventricularwetweight， LVWW）。 取部分用 10%中性甲醛固定， 部分制備心肌組織勻漿， 剩余放入 -80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 生化指標(biāo)測定 取心肌組織勻漿， 分別按試劑盒說明書操作方法， 測定心肌 HYP、 AngⅡ水平。

1.4.3 心肌組織膠原纖維觀察 將 10%中性甲醛固定后的心肌組織石蠟包埋， 行 MASSON染色，光鏡下觀察膠原纖維改變。每張切片使用 IPP圖像分析軟件 （北京中晟天成科技有限公司），測量選定區(qū)染色組織的面積 （藍(lán)色代表膠原纖維）； 計算方法： 心肌膠原容積分?jǐn)?shù) （%） =心肌膠原面積/總面積 （其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積）， 每張切片隨即抽取 10 個視野 （×400）， 計算每個視野中膠原面積占總面積的百分比，取平均值。

1.4.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR） 分析 心 肌 MMP-1 及 TIMP-1 mRNA 的 表 達(dá) 用TRNzol-A+ 從 心 肌 組 織 中 提 取 總 RNA （ 100 mg/mL）， 提取方法嚴(yán)格按照說明書操作。 隨后，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入 RNA 2 μg， 10 ×RTMix 2 μL， dNTP混合液 2 μL， Oligo-dT152 μL，Quant Reverse Transcriptase 1 μL， 最 后 加 入 RNase-free水， 使反應(yīng)總體積達(dá)到 20 μL。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37 ℃下反應(yīng) 60 min， 在 70 ℃下 15 min 使產(chǎn)物變性。 合成的 cDNA于-20 ℃下保存。 PCR模板 （南京金斯瑞生物科技有限公司） 如下： MMP-1 上游引物 5 ’-CTTCAGTGGTGATGTTCAGC-3 ’， 下 游 引物 5’-CATCGATATGCTTCAACGTTC-3’， 產(chǎn)物長度412 bp； TIMP-1 上游引物 5’-TTCCACAGGTCCCACAAC-3’， 下游引物 5’-GCATTCCTCACAGCCAAC-3’， 產(chǎn) 物 長 度 165 bp； β-actin 上 游 引 物： 5 ’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’， 下 游 引 物 5 ’-ACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3’，產(chǎn) 物 長 度 230 bp。 PCR反應(yīng)體系如下［7］： 1 μL模板 cDNA， 1 μL上游引物， 1 μL下游引物， 2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL， 加入雙蒸水使反應(yīng)總體積達(dá)到 25 μL。每個 PCR反應(yīng)如下，預(yù)變性： 94 ℃預(yù)變性 3 min、94 ℃變性 50 s， 54 ℃退火 50 s、 72 ℃延伸 90 s、擴增循環(huán)后 72 ℃ 繼續(xù) 延伸 5 min； 其 中 MMP-1、TIMP-1、 β-actin 的擴增循環(huán)數(shù)依次為 35、25、 24，退火溫度依次為 53 ℃、50 ℃、 54 ℃。 取 PCR產(chǎn)物 8 μL加 5 ×Loading Buffer 2 μL于 2%瓊脂糖凝膠電泳， 隨后用溴化乙啶染色， 利用 JD801 系列凝膠成像系統(tǒng) （江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司） 半定量分析心肌 MMP-1 及 TIMP-1 mRNA表達(dá)， 結(jié)果以目的條帶的積分光密度與相關(guān) β-actin 積分光密度的比值表示。

1.4.5 Western-Blot分析心肌 MMP-1 及 TIMP-1 蛋白的表達(dá) 從心肌中提取蛋白樣本， 加入 SDSPAGE上樣緩沖液， 沸水煮 10 min， 然后 3 000 r/min離心 1 min 混勻。 變性后的蛋白在 12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離（SDS-PAGE）。電泳后的條帶用轉(zhuǎn)印緩沖液轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后，硝酸纖維素膜用封閉液（5%脫脂牛奶） 在室溫下孵育以阻斷反應(yīng)， 用TBS-T（TBS 1 000mL∶Tween20 500 μL）洗 4 次。硝酸纖維素膜用 一 抗 （ MMP-1，1 ∶300 稀 釋；TIMP-1， 1 ∶300 稀釋） 和 β-actin （1 ∶1 000 稀釋）在 4 ℃下孵育過夜并用 PBS-T洗 3 次。 該膜在室溫下二抗孵育 （1 ∶1 000 稀釋） 2 h。 參照 DAB試劑盒說明書取膜顯色， 條帶以目的蛋白與相關(guān) β-actin 積分光密度 （ IOD） 的比值表示， 結(jié)果以 JD801系列凝膠成像系統(tǒng) （江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）半定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采 用 SPSS 13.0 軟件， 組 間 比 較用單因素方差分析。所有的結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左室質(zhì)量指數(shù) （LVWI）的改變 與假手術(shù)組相比， 模型組大鼠 LVWI顯著增加 （P＜0.01）。與模型組相比，除葛根素低劑量組外其他各給藥組LVWI顯著降低 （P＜0.01 或 P＜0.05），其中聯(lián)用組 LVWI效果最好 （P＜0.05） （表 1）。

表1 各用藥組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、 左心室質(zhì)量指數(shù)、 心肌羥脯氨酸及血管緊張素Ⅱ水平的變化 （， n=8）Tab.1 Collagen volume fraction， LVW I and levels of HYP and AngⅡ in m yocardium in all groups（， n=8）

表1 各用藥組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、 左心室質(zhì)量指數(shù)、 心肌羥脯氨酸及血管緊張素Ⅱ水平的變化 （， n=8）Tab.1 Collagen volume fraction， LVW I and levels of HYP and AngⅡ in m yocardium in all groups（， n=8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01； 與葛根素高劑量組比較，△P＜0.05； 葛根素中劑量組比較，☆P＜0.05； 與氯沙坦組比較，▲P＜0.05

組 別 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)/%左心室質(zhì)量指數(shù)/（mg·g-1）心肌羥脯氨酸/（μg·g-1）血管緊張素Ⅱ/（pg·100-1·mg-1）假手術(shù)組 1.75 ±0.30## 1.68 ±0.15## 300.33 ±27.73## 489.69 ±55.85##模型組 5.99 ±0.86** 2.69 ±0.23** 465.67 ±25.11** 761.66 ±87.28**氯沙坦組 3.11 ±0.48##** 2.18 ±0.22##** 388.50 ±24.19##** 774.78 ±53.15##**葛根素高劑量組 3.25 ±0.34##** 2.20 ±0.11##** 392.33 ±23.38##** 635.28 ±65.38##**葛根素中劑量組 4.03 ±0.52##** 2.39 ±0.23#** 419.83 ±19.59##** 690.20 ±75.62#**葛根素低劑量組 5.13 ±0.43##** 2.57 ±0.27** 440.17 ±16.29#** 753.62 ±55.99**聯(lián)用組 2.50 ±0.26##*△▲☆ 1.94 ±0.10#*△▲☆ 361.33 ±19.58##**△▲☆ 540.38 ±32.44##△▲☆

2.2 左室心肌組織膠原纖維的改變及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的改變

2.2.1 左室心肌組織膠原纖維的改變 光鏡下發(fā)現(xiàn)膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞間隙增大，心肌纖維排列紊亂，胞核深染、增大，藍(lán)色膠原纖維沉積明顯。給予葛根素與氯沙坦治療后，各組心肌纖維化程度均減輕， 聯(lián)用組效果最好 （圖1）。

2.2.2 左室心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的改變 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比， 各用藥組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)明顯降低 （P＜0.01 或 P＜0.05）， 且葛根素各劑量組間呈劑量依賴性 （P＜0.01）。 與葛根素高、中劑量組及氯沙坦組相比，聯(lián)用組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)顯著降低 （P＜0.05）（表 1）。

3 生化指標(biāo)測定結(jié)果

3.1 左室心肌 HYP水平的變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左室心肌羥脯氨酸 （HYP） 水平明顯升高 （P＜0.01）。 與模型組相比， 各用藥組大鼠左室心肌 HYP水平明顯降低 （P＜0.01 或 P＜0.05）， 其中聯(lián)用組效果最好 （P＜0.05）， 且葛根素各劑量組間呈劑量依賴性 （P＜0.05） （表 1）。

3.2 左室心肌 AngⅡ水平的變化 與假手術(shù)組相比， 模型組大鼠心肌局部 AngⅡ 水平明顯升高（P＜0.01）。 與模型組相比， 葛根素高、 中劑量組及聯(lián)用組心肌 AngⅡ水平明顯降低 （P＜0.01 或P＜0.05）， 其中聯(lián)用組效果最好 （P＜0.05）。 氯沙坦組心肌 AngⅡ水平有升高趨勢 （P＞0.05）（表1）。

4 左室心肌 MMP-1、 TIMP-1 mRNA與蛋白表達(dá)的變化

4.1 左室心肌 MMP-1、 TIMP-1mRNA表達(dá)的變化與假手術(shù)組相比， 模型組大鼠左室心肌 MMP-1及 TIMP-1 mRNA表達(dá)及兩者比值顯著升高 （ P＜0.01）。 與模型組比較， 葛根素高劑量組、 氯沙坦組和聯(lián)用組左室心肌 MMP-1 與 TIMP-1 mRNA表達(dá)以及兩者比值顯著降低 （P＜0.01 或 P＜0.05），其中聯(lián)用組效果最好 （P＜0.05） （圖 2）。

圖 1 各組大鼠心肌 M asson染色 （ ×400） 變化Fig.1 Typical slices stained by Masson stain（ ×400） for levels ofmyocardial fibrosis in all groups

圖 2 各組大鼠左室心肌 MMP-1 與 TIM P-1 基因 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖及其與 β-actin的光密度比值Fig.2 Expressions of MMP-1 and TIMP-1 gene product electrophoresis figure for RT-PCR and the ratios of optical density values of their to β-actin in the righ t kidney in all groups

4.2 各用藥組大鼠左室心肌組織 MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)的變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左室心肌 MMP-1 及 TIMP-1 蛋白表達(dá)及兩者比值顯著升高 （P＜0.01）。 與模型組比較， 葛根素高劑量組、 氯沙坦組和聯(lián)用組心肌 MMP-1 與 TIMP-1 蛋白表達(dá)以及兩者比值顯著降低 （P＜0.01 或 P＜0.05）， 聯(lián)用組效果更好 （P＜0.05） （圖 3）。

圖 3 各組大鼠左室心肌 MM P-1 與 TIMP-1 蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of MMP-1 and TIMP-1 protein in the left ventricle in all groups

5 討論

兩腎一夾大鼠模型中腎組織的缺血可激活循環(huán)和局部腎素-血管緊張素系統(tǒng) （RAS）。 業(yè)已證實，心肌局部 RAS的過度激活會引起心肌纖維化， 導(dǎo)致心肌重構(gòu)［8］。 RAS 中 AngⅡ是心肌重構(gòu)早期的重要調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的基因表達(dá)［9］，抑制細(xì)胞外基質(zhì) （EMC） 降解的關(guān)鍵酶 MMPs， 減少膠原的降解［10］。研究表明［11］， 心肌纖維化時 MMP-1 與 TIMP-1 表達(dá)增加，兩者比值增大，且兩者的比值增大會促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心衰大鼠模型中， IL-7 能通過升高心肌 MMP-1/TIMP-1 比值，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生［12］。 本實驗觀察到， 腎性高血壓大鼠模型組大鼠心 肌 MMP-1、 TIMP-1 mRNA表達(dá)增加，這與王先梅等［13］在心肌肥厚患者心肌組織中發(fā)現(xiàn)的一致。但有一些研究測得不同動物疾病模型心肌 MMP-1 與 TIMP-1 的表達(dá)及活性差異很大，這可能與兩者在各種疾病發(fā)展中的作用、兩者間相互的調(diào)節(jié)以及研究者測定的時期、所采用的測定方法有關(guān)。心肌發(fā)生病變初期，炎癥因子促使心肌 MMP-1 表達(dá)增加， 同時引起心肌 TIMP-1 的表達(dá)也增加， 但隨著病程的發(fā)展， MMP-1 表達(dá)逐漸減少， 可能是由于 TIMP-1 抑制其活性， 膠原的降解減少， 心肌 EMC沉積，導(dǎo)致心肌重構(gòu)。

本實驗發(fā)現(xiàn)， 腎性高血壓大鼠模型組心肌 AngⅡ水平、 MMP-1 及 TIMP-1 mRNA、 蛋白表達(dá)水平及其比值顯著升高。 心肌局部 AngⅡ水平升高，促使心肌膠原沉積。病程早期心肌可代償性增加MMP-1 的表達(dá)及活性， 抑制 TIMP-1 活性， 抑制膠原沉積。但隨著病程進(jìn)展，心肌膠原沉積加重，組織中 MMP-1 及 TIMP-1 平衡失調(diào)， 纖維化進(jìn)行性加重。葛根素及氯沙坦治療8周后，除氯沙坦組外其他各給藥組心肌 AngⅡ水平出現(xiàn)不同程度降低，MMP-1 與 TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)的比值不同程度降低，而這些變化均以聯(lián)用組效果最好。氯沙坦組 AngⅡ水平較模型組有升高趨勢， 這與劉守鉀等［14］的研究結(jié)果一致。 以上結(jié)果提示葛根素聯(lián)用氯沙坦對腎性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的改善具有協(xié)同作用， 其機制可能與降低心肌 AngⅡ水平、 下調(diào)心肌 MMP-1/TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)的比值有關(guān)。

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Effect of puerarin combined w ith losartan on ratio of MMP-1/TIMP-1 in m yocardium in renovascular hypertensive rats

HUANG Zhen-gui， CHEN Li， BAISong， WANG Jiang-tao， DING Bo-ping
（Department of Pharmacology&Pharmacology of TCM Grade Three Laboratory， State Administration of Traditional Chinese Medicine of P.R.China，Wannan Medical College， Wuhu 241002， China）

AIM To study the effect of puerarin combined with losartan on the ratio ofMMP-1/TIMP-1 mRNA and protein expression inmyocardium in renovascular hypertensive rats.M ETHODS Sixty-fivemale SD ratswere used.Eight ratswere randomly selected as sham operation group，and the restwere used tomake two-kidney-oneclip Goldblattmodel.The rats thatmet the criterion for Goldblatt hypertensive ratwere randomly assigned into six groups， high-， middle-and low-dose puerarin groups， losartan group， combination group and model group.After being administered for eightweeks， LVWI（left ventricular weight index）wasmeasured.Myocardial collagen fibers were evaluated through Masson trichromestaining； CVF （ collagen volume fraction ） ofmyocardium was also measured.The contents of HYP（hydroxyproline） and AngⅡ （ angiopoietin-Ⅱ） in myocardium were measured. ThemRNA and protein expression of MMP-1 and TIMP-1 in myocardium weremeasured by RT-PCR and Western blot.RESULTS Compared with themodel group， CVF and the contentof HYP inmyocardium in all drug-treated groups significantly decreased （ P＜0.01 or P＜0.05） ， and the above-mentioned effects were the best in the combination group （ P＜0.05）.The contents of AngⅡ inmyocardium in puerarin high-， middle-dose groups and the combination groupmarkedly decreased （ P＜0.01 or P＜0.05 ） ， and those in the combination group were the lowest.LVWI significantly decreased （ P＜0.01 or P＜0.05 ） in all drug-treated groups except low-dose puerarin.The ratio ofMMP-1/TIMP-1 mRNA and protein expressionmarkedly decreased （P＜0.05）， and those of the combination group （ P＜0.05 ） decreased the most.CONCLUSION A combination of puerarin with losartan can down-regulate the ratio ofMMP-1/TIMP-1 mRNA and protein expression in myocardium，and improvemyocardial fibrosis in renovascular hypertensive rats.

renal hypertensive rats； puerarin combined with losartan； myocardial fibrosis； ratio of MMP-1/ TIMP-1 mRNA and protein

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0462-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.005

2013-06-16

安徽省自然科學(xué)基金資助項目 （070413124）； 皖南醫(yī)學(xué)院博士啟動基金資助項目 （BK00010804）

黃幀檜 （1965—） ， 男， 博 士， 副 教 授， 碩 士 生 導(dǎo) 師， 研 究 方 向： 中 藥 藥 理 與 臨 床 藥 理。 Tel： （ 0553 ） 3932464， E-mail：huangzhenggui2006@aliyun.com