HPD-300 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷分離工藝的優(yōu)化

趙惠茹， 龍 靜， 楊黎彬， 邊軍昌

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 陜西 西安 710021）

HPD-300 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷分離工藝的優(yōu)化

趙惠茹， 龍 靜， 楊黎彬， 邊軍昌

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 陜西 西安 710021）

目的 研究大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷分離的最佳工藝。方法 通過(guò)比較山茱萸總皂苷在9種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹(shù)脂，應(yīng)用單因素分析和正交試驗(yàn)的方法對(duì)所選最佳樹(shù)脂純化山茱萸總皂苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果 HPD-300 型大孔樹(shù)脂具有良好的吸附與解吸性能， 確定的分離工藝參數(shù)為: 上樣溶液質(zhì)量濃度為 0.5 g/mL， 樹(shù)脂柱徑高比為 1 ∶7， 吸附體積流量為 2 BV/h， 每克干樹(shù)脂的最大吸附量為 1.125 g生藥。 吸附飽和后， 先用 3 BV蒸餾水洗脫去除水溶性雜質(zhì)， 再用 3.5 BV 50%乙醇進(jìn)行解吸附， 純化后的山茱萸總皂苷保留率和精制度分別為 92.6%和 394.5%。 結(jié)論 HPD-300 型大孔樹(shù)脂可作為純化山茱萸總皂苷的較佳分離材料， 經(jīng)過(guò)優(yōu)化的分離工藝穩(wěn)定可靠，可在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。

大孔樹(shù)脂；山茱萸；總皂苷

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉， 性溫、 味酸， 具有補(bǔ)肝腎、 澀精氣、 固虛脫的功效［1］。 其 化學(xué)成分主 要含有環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、 皂苷、 多糖、 熊果酸、 齊墩果酸、 鞣質(zhì)等［2-3］。 近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸具有抑菌抗病毒，調(diào)節(jié)人體免疫功能，降血糖和抗衰老等作用，山茱萸總皂苷有明顯的免疫抑制活性［4-5］。 大孔吸附樹(shù)脂作為一種選擇性吸附劑， 具有吸附和解吸速度快、吸附容量大、容易再生、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)， 現(xiàn)已被廣 泛應(yīng)用 于皂苷 的分離和 富 集［6-11］。 但在山茱萸總皂苷分離方面只有初步研究［12-14］， 現(xiàn)有文獻(xiàn)并未對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的分離純化工藝進(jìn)行系統(tǒng)全面的報(bào)道。為了獲得最佳分離工藝參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)比較了9種大孔樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷的吸附和解吸性能，篩選出效果最佳的樹(shù)脂型號(hào)。以純化后山茱萸樣品中總皂苷含量為指標(biāo)，通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)的方法對(duì)影響吸附和解吸附過(guò)程的主要因素進(jìn)行了綜合考察，以期為開(kāi)發(fā)和利用山茱萸總皂苷提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器 UV-160A型 紫 外分光光 度 計(jì) ( 日 本 島津)；DZKW-D-2 型智能數(shù)顯恒溫水浴箱 (北京市永光明醫(yī)療儀器廠) ； BP211D型 精 密 電 子 天 平 ( 德 國(guó) Sartorius公 司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)； SHZ-D循環(huán)水式真空泵 (河南鞏義市英峪予華儀器廠)； DHG 9000 系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海安亭科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 山茱萸藥材 (產(chǎn)地為陜西洋縣) 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室楊黎彬 博 士 鑒 定 為 山 茱 萸 科 植 物 山 茱 萸 (Cornus officinalis Sieb.et Zucc.) 的成熟果肉； 人參皂苷 Re對(duì)照品 ( 中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所)； 大孔吸附樹(shù)脂 HPD-722、 NKA-9、AB-8、 HPD-600、 S-8、 HPD200A、 DM-130、 NKA-Ⅱ、HPD-300 均購(gòu)自陜西藍(lán)深科技有限公司； 甲醇 (色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取人參皂苷 Re對(duì)照品6.1 mg， 加適量甲醇溶解并定容至 5 mL， 精密吸取 10、15、 20、 25、 50 μL于具塞試管中， 揮干溶劑， 精密加入新鮮配制的 5%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 m L、 高氯酸 0.8 mL，振搖混 勻后 于 65 ℃ 水浴加熱 20 min， 取 出， 冰 水 冷 卻2 min后， 加冰醋酸 5 mL搖勻， 隨行試劑空白， 以精密吸取 20 μL對(duì)照品的溶液在 400 ～800 nm范圍內(nèi)掃描， 測(cè)得人參皂苷 Re的最大吸收波長(zhǎng)為 554 nm， 故選擇 554 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。 以吸光度 A為縱坐標(biāo)， 人參皂苷 Re質(zhì)量濃度 C為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算得回歸方程:A=22.045C +0.134 5， r=0.998 9， 線性范圍為 12.2 ～61 μg。

2.1.2 山茱萸總皂苷測(cè)定 吸取待測(cè)山茱萸樣品液一定量， 水浴揮干， 按照 “2.1.1” 項(xiàng)下方法自 “精密加入新配制的 5%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL” 起， 依法測(cè)定吸收度，并用回歸方程計(jì)算即得。

2.2 山茱萸樣品溶液的制備 稱(chēng)取干燥粉碎后的山茱萸粗粉 (40 目)， 加 10 倍量70%乙醇回流提取 3 次， 每次 2 h，合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，加6倍量蒸餾水冰箱冷藏過(guò)夜，離心，上清液減壓濃縮得質(zhì)量濃度為1.0 g生藥/mL的山茱萸上樣原液， 備用。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理［15］根據(jù)山茱萸中所含有效成分的理 化 性 質(zhì) 和 大 孔樹(shù) 脂 的 吸附 性 能， 選 用 HPD-722，NKA-9， AB-8， HPD-600， S-8， HPD200A， DM-130， NKA-Ⅱ， HPD-300 共 9 種型號(hào)的大孔樹(shù)脂分別用 95%乙醇室溫浸泡 24 h， 傾去上層乙醇， 濕法裝柱， 繼續(xù)用 95%乙醇以1.5 BV/h 的體積流量過(guò)柱， 至流出液加 5 倍量水不產(chǎn)生白色渾濁為止， 用去離子水沖洗至中性， 然后用3 BV 5%HCl溶液浸泡2 h后用去離子水洗至流出液呈中性， 再用3 BV 5%NaOH溶液浸泡 2 h， 最后用足量的去離子水洗至流出液呈中性，備用。

2.4 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)篩選 精密稱(chēng)取處理后的 9 種大孔吸附樹(shù)脂各 5 g， 分別置于 9 只 50 mL具塞錐形瓶中， 用吸量管精密加入上柱溶液 20 mL， 每隔 10 min 振搖 20 s， 持續(xù) 2 h。 靜置 24 h 后， 過(guò)濾， 得吸附后濾液。 測(cè)定吸光度，代入回歸方程求出濾液中山茱萸總皂苷質(zhì)量濃度，計(jì)算比吸附量和吸附率。 將過(guò)濾后的樹(shù)脂另置 50 mL具塞錐形瓶中， 分別精密加入 50%乙醇 20mL， 每隔 10min 振搖 20 s，持續(xù)2 h， 靜置8 h后， 濾過(guò)， 同法測(cè)定濾液中總皂苷質(zhì)量濃度， 計(jì)算比解吸量和解吸率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 9種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷吸附與解吸性能

由表 1 可見(jiàn) AB-8 型大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率分別為82.5% 和 77.1%， HPD-300 型大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率分別為 88.7% 和 76.2%， 均高于其他 7 種型號(hào)樹(shù)脂。 雖然HPD-300 型大孔樹(shù)脂的解吸率低于 AB-8 型大孔樹(shù)脂 0.9%，但是吸附率高出 6.2%， 故選擇 HPD-300 型大孔樹(shù)脂分離純化山茱萸總皂苷。

2.5 HPD-300 型大孔樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷吸附的影響因素考察

2.5.1 藥液質(zhì)量濃度、 樹(shù)脂柱徑高比及吸附體積流量 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，藥液質(zhì)量濃度、樹(shù)脂柱徑高比、吸附體積流量對(duì)吸附影響較大。因此采用正交試驗(yàn)法，所選因素為藥液質(zhì)量濃度、樹(shù)脂柱徑高比、吸附體積流量，每個(gè)因素選擇 3 個(gè)水平， 按照 L9(34) 正交表安排試驗(yàn)， 以大孔樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷的比吸附量為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最佳吸附條件， 結(jié)果見(jiàn)表2 ～4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表 3 L9（34） 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表3可以看出，各因素對(duì)吸附條件的影響程度依次為B＞C＞A。 方差分析表明， 因素A對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，因素B和C均有顯著性差異。因此，確定最佳水平組合為 A3B1C2， 即藥液質(zhì)量濃度為 0.5 g生藥 /mL， 樹(shù)脂柱徑高比 1 ∶7， 吸附體積流量為 2 BV/h。

2.5.2 飽和吸附量 取 20 g HPD-300 型大孔吸附樹(shù)脂裝于色譜柱 (20 mm×300 mm) 中， 在上述優(yōu)化條件下， 取 100 m L山茱萸上柱藥液加入到樹(shù)脂床中， 按照每流份5 mL等體積收集吸附后的流出液， 共收集 20 份。 按照 “2.1.2”項(xiàng)方法測(cè)定每個(gè)流份的吸光度，代入回歸方程求出總皂苷質(zhì)量濃度。以收集的流份編號(hào)為橫坐標(biāo)，總皂苷質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線， 見(jiàn)圖1。

圖 1 山茱萸總皂苷在 HPD-300 型大孔樹(shù)脂上的泄露曲線

由試驗(yàn)結(jié)果可知， 流份 10中總皂苷質(zhì)量濃度是流份 9的 8.7 倍， 即樹(shù)脂柱出現(xiàn)泄漏現(xiàn)象， 此時(shí)樣品總上柱體積為 45mL， 相當(dāng)于含有 22.5 g生藥， 因此確定 HPD-300 型大孔樹(shù)脂的飽和吸附量為每克樹(shù)脂吸附 1.125 g生藥。

2.6 HPD-300 型大孔樹(shù)脂對(duì)山茱萸總皂苷解吸附的影響因素考察

2.6.1 解吸溶劑質(zhì)量濃度 取 100 mL山茱萸總皂苷樣品溶液 (0.5 g生藥/mL)， 以 2 BV/h 的體積流量通過(guò)裝有20 g HPD-300 型大孔樹(shù)脂的色譜柱 (20 mm×300 mm)， 待充分吸附后， 先用 水洗至流出液 molish 反應(yīng) 呈陰性， 依次用10%、 30%、 50%、 70%和 90%乙醇以1 BV/h 的體積流量進(jìn)行梯度洗脫，每種質(zhì)量濃度的洗脫液各收集5份，每份10mL， 測(cè)定其中總皂苷的質(zhì)量濃度， 以流份編號(hào)為橫坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)， 繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度解吸溶劑的考察

由洗脫曲線可見(jiàn)山茱萸總皂苷主要集中在 50%乙醇洗脫液中， 占全部醇洗脫液中山茱萸總皂苷的 79.7%。 由于50%乙醇具有良好的解吸附能力， 而水和 90%乙醇洗脫部分基本不含皂苷，因此洗脫時(shí)，先用蒸餾水洗去糖類(lèi)等水溶性雜質(zhì)， 再用 50%乙醇洗脫總皂苷。

2.6.2 洗脫體積流量 在上述優(yōu)化條件下， 裝 4 根 HPD-300 型大孔樹(shù)脂柱 (20mm×300mm)， 用 50%乙醇分別以1、 2、 3、 4 BV/h 體積流量進(jìn)行洗脫， 各收集 8 倍量洗脫液，測(cè)定洗脫液的吸光度，代入回歸方程求出總皂苷質(zhì)量濃度， 計(jì) 算 解 吸 率。 解 吸 率 分 別 為 93.2%、 91.6%、85.3%、 76.5%， 結(jié)果可見(jiàn)體積流量越慢， 解吸率越高。當(dāng)體積流量為 2 BV/h 時(shí)， 解吸率比體積流量 1 BV/h 稍小，但是可以縮短一半洗脫時(shí)間，考慮到生產(chǎn)效率，最后選擇2 BV/h 為洗脫體積流量。

2.6.3 解吸溶劑最佳用量 取 100 mL山茱萸總皂苷樣品溶液 (0.5 g生藥/mL)， 在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行試驗(yàn)， 吸附完全后， 先用 3 BV水洗脫至流 出液 molish 反應(yīng)呈陰 性，再用50%乙醇洗脫， 等體積收集乙醇洗脫液15 份， 每份10 m L。 按照 “2.1.2” 項(xiàng)方法測(cè)定每個(gè)流份的吸光度， 計(jì)算總皂苷的質(zhì)量濃度，以流份編號(hào)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)， 繪制洗脫曲線， 見(jiàn)圖3。

圖 3 山茱萸總皂苷在 HPD-300 型大孔樹(shù)脂上的洗脫曲線

由圖3可知， 流份10中總皂苷的質(zhì)量濃度非常低， 可見(jiàn)大孔樹(shù)脂柱中吸附的山茱萸總皂苷已基本解吸完全，此時(shí)溶劑用量為 100 mL。 因此確定 50% 乙醇最佳用量為3.5 BV。

2.7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照 “2.2” 項(xiàng)方法制備 30 mL質(zhì)量濃度為 0.5 g/mL的山茱萸樣品溶液， 用 HPD-300 型大孔樹(shù)脂裝柱，按照最佳吸附條件充分吸附后， 先用3 BV蒸餾水洗脫至流出液 molish 反 應(yīng) 呈 陰 性， 再 用 3.5 BV 50% 乙 醇 洗脫，收集乙醇洗脫液。分別測(cè)定樣品溶液和經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂柱后 50%乙醇洗脫液的吸光度， 代入回歸方程求出總皂苷質(zhì)量濃度，按經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后山茱萸總皂苷質(zhì)量與未經(jīng)處理的樣品溶液中山茱萸總皂苷質(zhì)量之比計(jì)算純化保留率。 同法重復(fù)3次試驗(yàn)， 結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 山茱萸總皂苷純化保留率

從表 5 得知， 山茱萸總皂苷經(jīng)過(guò) HPD-300 型大孔樹(shù)脂純化后的平均保留率為 92.6%。 結(jié)果表明， 在應(yīng)用該大孔樹(shù)脂純化時(shí)，山茱萸總皂苷損失很少。

2.8 精制度試驗(yàn)［16］按照 “2.2” 項(xiàng)方法制備 60 mL質(zhì)量濃度為 0.5 g/mL的山茱萸樣品溶液， 等體積分成兩份， 一份在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行大孔樹(shù)脂純化試驗(yàn)， 得到 50%乙醇洗脫液，另一份為樣品原液，將這兩種溶液分別減壓濃縮、干燥后得到浸膏，測(cè)定總皂苷的含量，按照經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后洗脫液固形物中總皂苷含量與樣品原液固形物中總皂苷含量之比計(jì)算精制度。同法重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果可見(jiàn)， 樣品溶液經(jīng)過(guò) HPD-300 型大孔樹(shù)脂后， 精制度分別為 402.3%、 394.7%、 386.5%， 說(shuō)明該工藝實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，對(duì)山茱萸總皂苷有較好的富集純化作用。

3 討論

3.1 采用單因素分析和正交試驗(yàn)的方法對(duì) HPD-300 型大孔樹(shù)脂純化山茱萸提取液中總皂苷的工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，在藥液質(zhì)量濃度為0.5 g/mL， 每克樹(shù)脂的吸附量為1.125 g生藥， 吸附體積流量為 2 BV/h， 樹(shù)脂柱的徑高比為 1 ∶7 的條件下， 吸附效果最好； 以 3.5 BV 50%乙醇洗脫， 洗脫體積流量為 2 BV/h， 總皂苷 保留率為 92.6%， 精制度可達(dá)394.5%， 說(shuō)明該樹(shù)脂分離純化山茱萸總皂苷是可行的。

3.2 曾有文獻(xiàn)［13］報(bào)道水洗脫部位經(jīng)薄層鑒別含有皂苷，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水只能洗脫除去糖類(lèi)等極性較大的雜質(zhì)，對(duì)總皂苷基本沒(méi)有洗脫， 而 30%乙醇洗脫的總皂苷占全部醇洗脫液中總皂苷的 14.7%， 山茱萸總皂苷主要集中在 50%乙醇洗脫液中。因此經(jīng)吸附飽和的樹(shù)脂，先用蒸餾水洗至流出液 molish 反應(yīng)呈陰性， 再用 50%乙醇 洗脫總皂苷， 此工藝溶劑用量少，洗脫效果好。

3.3 由于山茱萸皂苷與香草醛-冰醋酸試劑的顯色反應(yīng)受溫度、顯色時(shí)間等因素的影響較大，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制顯色時(shí)間和反應(yīng)溫度，尤其在加入醋酸和測(cè)定吸光度之前，樣品一定要置于冰水浴中，并及時(shí)測(cè)定，否則將會(huì)產(chǎn)生較大的實(shí)驗(yàn)誤差。

［ 1 ］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:26.

［ 2 ］ 劉華亮， 袁 珂， 陳年者， 等.山茱萸炮制前后的 HPLC指紋圖譜研究［ J］ .中國(guó)藥房， 2012， 23(3):234-237.

［3］ 吳 紅，梁 恒，劉永紅， 等.山茱萸總皂苷的提取分離與含量測(cè) 定 ［ J］.第四軍 醫(yī)大 學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 24(5): 430-432.

［ 4 ］ 袁菊麗， 姜紅波.山茱萸的主要化學(xué)成分及藥理作用［J］.化學(xué)與生物工程， 2011， 28(5):7-9.

［5］ 徐建國(guó)，田呈瑞，胡青平， 等.醇提山茱萸皂苷的體外抗氧化活性研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2008， 8(5):33-36.

［6］ 皮文霞， 蔡寶昌， 潘 揚(yáng)， 等.大孔樹(shù)脂與活性炭富集山茱萸 總 苷 的 實(shí) 驗(yàn) 研 究 ［ J］.中 藥 材， 2002， 25(5): 349-351.

［7］ 歐陽(yáng)麗娜，吳 雪，李蘭林，等.大孔吸附樹(shù)脂富集純化竹節(jié)參總皂苷工藝條件優(yōu)選［ J］.中成藥， 2011， 33(7): 1163-1168.

［8］ 彭 亮，李知敏，祝珍芳.大孔吸附樹(shù)脂純化蒺藜中總皂苷工藝的優(yōu)化［J］.中成藥， 2011， 33(5):886-889.

［9］ 霍麗麗， 姚 干， 龍 永， 等.大孔吸附樹(shù)脂法富集純化女貞子總皂苷的工藝研究［J］.中成藥， 2009， 31(10): 1522-1526.

［10］ 王艷宏， 李永吉， 馮彩麗， 等.大孔吸附樹(shù)脂在皂苷研究中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊， 2004， 22(2):373-374.

［11］ 平 靜， 李 清， 陳曉輝， 等.大孔吸附樹(shù)脂純化山藥總皂苷的工藝研究［J］.中成藥， 2011， 33(10):1810-1813.

［12］ 吳 紅， 梁 恒， 吳道澄， 等.大孔吸附樹(shù)脂法分離純化山茱萸總皂 苷［ J］.第四 軍醫(yī)大學(xué)學(xué) 報(bào)， 2003， 24(8): 689-692.

［13］ 李欣孺， 趙 峰， 龍 偉， 等.山茱萸總皂苷的大孔吸附樹(shù)脂分離與純化研究 ［J］.醫(yī)藥導(dǎo) 報(bào)， 2009， 28(6): 767-770.

［14］ 徐建國(guó)， 胡青平， 田呈瑞， 等.大孔吸附樹(shù)脂純化山茱萸總皂苷的動(dòng)態(tài)吸附條件研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)， 2005， 25 (11):2330-2334.

［15］ 賈存勤， 李陽(yáng)春， 屠鵬飛， 等.HPD系列大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理方 法 研 究 ［ J］.中 國(guó) 中 藥雜志， 2005， 30(18): 1425-1427.

［16］ 孫宗喜， 徐桂花， 李艷芳， 等.大孔樹(shù)脂純化綿茵陳中總有機(jī)酸和綠原酸的研究 ［J］.中藥 材， 2012， 35(2): 306-310.

R284.2

:B

:1001-1528(2014)02-0416-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.048

2013-02-20

陜西省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目 (ZY04)

趙惠茹 (1972—) ， 女， 碩士， 副教授， 主要從事天然藥物研究與開(kāi)發(fā)。 E-mail:wang-gq@chd.edu.cn