秦皮甲素對肺癌小鼠抑瘤作用的研究

王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 遼寧 錦州 121000）

秦皮甲素對肺癌小鼠抑瘤作用的研究

王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 遼寧 錦州 121000）

目的 探討秦皮甲素對小鼠肺癌移植瘤的影響及作用機制。 方法 分組對比觀察秦皮甲素對小鼠 Lewis肺癌移植瘤的影響， 瘤組織稱重計算抑瘤率， 免疫印跡法檢測秦皮甲素對凋亡基因 Bax、 Bcl-2 的影響。 流式細胞儀檢測瘤細胞增殖周期及凋亡， JC-1 染色檢測線粒體膜電位。 結(jié)果 秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生長和瘤細胞的增殖周期， 降低線粒體膜電位， 在上調(diào) Bax蛋白表達的同時下調(diào) Bcl-2 蛋白表達， 且呈劑量依賴性。 結(jié)論 秦皮甲素對小鼠肺癌移植瘤有顯著的抑制作用。使腫瘤細胞阻滯于S期，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。

秦皮甲素；肺癌；線粒體途徑

秦皮甲素是中藥秦皮中的主要成分，在秦皮中含有量高 (1.436% ～3.043%)。 秦皮甲素是秦皮發(fā)揮藥理作用最重要的成分，對機體各系統(tǒng)作用廣泛，具有抗腫瘤、抗微生物、抗氧化與消除自由基等作用［1］。 在前期我們研究了秦皮甲素對肺癌細胞 H125 的影響， 發(fā)現(xiàn)秦皮甲素可抑制肺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［2］。 但是， 秦皮甲素在體內(nèi)對肺癌移植瘤模型是否發(fā)揮作用，對腫瘤相關(guān)癌基因與抑癌基因的表達是否有影響等方面還需要進一步探討。因此，我們需要利用現(xiàn)代藥學(xué)研究手段，對秦皮甲素抗肺癌作用進行研究，掌握其作用機制，以更好地利用我國獨特的中藥資源優(yōu)勢，為臨床服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物及瘤株 C57BL/6 j小鼠， 雄性， 6 ～8周齡， 20 ～22 g。 購于中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

Lewis肺癌細胞株， 購于中國科學(xué)院上海分院細胞庫。

1.2 藥物 秦皮甲素， 購于中國藥品生物制品檢定 所， 批 號 200104。順 鉑， 批 號 20120902 (江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)。 兔抗人 Bax抗體 (SANTA CRUZ公司， 型號 SC—526)。 兔抗人 Bcl-2 抗 體 (SANTA CRUZ公 司， 型 號 為 SC-429)。

1.3 試 劑 線 粒 體 膜 電 位 檢 測 試 劑 盒 (JC-1) (碧云天生物技術(shù)研究所)； 線粒體提取試劑盒(南京建成生物工程研究所)； 胰蛋白酶 (Hyclone公司)； 小牛血清 (杭州四季青生物制品公司)；DMEM培 養(yǎng) 基 干 粉 (GIBCO 公 司 ) ； Annexin VFITC凋亡試劑盒 (北京寶賽生物公司)； 碘化丙啶(Amresco公司)； 細胞周期檢測試劑盒 (南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.4 儀器 流式細胞儀 (BD FACSCaLibur)； 超凈工作臺 (江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所)； 二氧化碳 培 養(yǎng) 箱 (Sheldon Manufacturing IncUSA)； KA-1000C型飛鴿離心機 (上海安亭科學(xué)儀器廠)；CX21 型雙目生物 顯 微 鏡 ( 日本 Olympus公 司)；WD-9413B型凝膠成像分析儀 (上海圣科儀器設(shè)備有限公司)； DYY-7C型電泳儀 ( 北京六一儀器廠)。

2 試驗方法

2.1 動物模型的建立 Lewis細胞常規(guī)復(fù)蘇， 傳代， 用含 10% 小牛血清 的 培 養(yǎng) 基， 在 5%CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。 0.25%胰蛋白酶消化傳代， 待細胞長至 80%融合時進行實驗。 取對數(shù)生長期細胞， 調(diào)整細胞密度為 2 ×108個/mL。將制備好的單細胞懸液接種于小鼠右腋皮下，每只0.2 mL。模型復(fù)制成功后，隨機分為 5 組，每組15 只， 即陰性對照組 (生理鹽水 0.2 mL)； 陽性對照組 (順鉑 100 mg/kg)； 秦皮甲素高、 中、 低劑量組 (400、 200、100 mg/kg)。用藥后第 20 天處死全部小鼠， 進行指標(biāo)觀察［3-5］。

2.2 抑瘤率 取各組瘤組織稱定質(zhì)量， 計算抑瘤率。 抑瘤率 (%)=(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重) ×100%

2.3 細胞周期檢測 取少許瘤組織， 用生理鹽水研磨， 4 ℃預(yù)冷， 70%乙醇固定， 檢測前離心棄去固定液， PBS液重懸， 然后按照細胞周期檢測試劑盒的要求進行操作。用流式細胞儀分析細胞周期［4］。

2.4 細胞凋亡檢測 取少量瘤組織， 用生理鹽水研 磨， 采 用 Annexin V-FITC 染 色， 加 入10μLAnnexinV-FITC和 5 μLPI， 輕輕混勻， 室溫避光反應(yīng) 10 ～15 min 后用流式細胞儀進行檢測。 所得數(shù) 據(jù) 經(jīng) Bioconsort專 用 軟 件處理， 分析 細 胞 凋亡率［5］。

2.5 JC-1 染色檢測線粒體膜電位 稱取 200 mg瘤組織， PBS 沖洗， 制備細胞勻漿。4 ℃ 800 ×g離心 5 min。 在另 一 個 新 的 預(yù) 冷 的 離 心 管中 加 入0.5 mL Medium Buffer， 將勻漿后的上清液沿管壁小心加入該離心管中， 4 ℃ 15 000 ×g離心 10min，上清轉(zhuǎn)移至新離心管。重懸線粒體沉淀，4℃15 000 ×g離心 10 min， 棄 上 清。 用 50 mL Store Buffer重懸線粒體沉淀。 然后按線粒體膜電位檢測試劑盒的說明書操作。用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果用綠色熒光細胞百分率表示。

2.6 免疫印跡法檢測 Bax、 Bcl-2 蛋白的表達 將存于 -80 ℃冰箱中的組織解凍加入裂解液， 于4 ℃下裂解 30 min， 4 ℃高速離心后取上清液并測定蛋白含有量， 加入上樣緩沖液混勻， -20 ℃冰箱中保存。應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)， 半干法轉(zhuǎn)膜。 加入一抗， 4 ℃過夜， 洗膜。加入二抗，室溫下在搖床上雜交 1 h，洗膜3次。顯色，結(jié)果應(yīng)用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描照相［6］。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。 進行 t檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 秦皮甲素對小鼠移植瘤的抑制作用 秦皮甲素治療后，秦皮甲素組和順鉑組瘤重較陰性對照組明顯減輕 (P＜0.05)， 結(jié)果見表1。 因秦皮甲素中劑量組和順鉑組的抑瘤率無明顯差異。因此在以后的檢測試驗中，我們僅選用秦皮甲素中劑量組與順鉑組進行比較。

3.2 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞周期的影響 各組小鼠腫瘤細胞周期各時相的分布數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，順鉑組和秦皮甲素組均可以使瘤細胞G2/M期的比例減少， S 期的比例增加。與陰性對照組比較， 差異顯著 (P＜0.05)。

3.3 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞凋亡的影響 由表3可見，秦皮甲素組與順鉑組均可誘導(dǎo)瘤細胞凋亡，與生理鹽水組比較差異顯著 (P＜0.05)。

表 1 秦皮甲素對小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表 1 秦皮甲素對小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量 /(mg·kg-1·d-1)動物數(shù) /只瘤重指數(shù)抑瘤率 /%生理鹽水組-151.310 2 ±0.102 4-順鉑組100150.581 7 ±0.001 355.6%**秦皮甲素低劑量組100150.741 5 ±0.015 843.41%**秦皮甲素中劑量組200150.601 3 ±0.017 254.1%**秦皮甲素高劑量組400150.478 2 ±0.005 163.5%**

表2 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞周期的影響（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

表2 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞周期的影響（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

注: 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別G0/G1SG2/M生理鹽水組35.930 ±0.035.850 ±0.0235.210 ±0.04順鉑組32.390 ±0.079.970 ±0.05*27.150 ±0.09*秦皮甲素組30.238 ±0.239.820 ±0.05*26.090 ±0.15*

表3 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞凋亡的影響（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表3 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞凋亡的影響（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別凋亡率/%生理鹽水組0.08 ±0.017順鉑組12.310 ±0.095**秦皮甲素組13.529 ±0.054**

3.4 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響 JC-1 熒光探針檢測線粒體膜電位， 結(jié)果顯示，順鉑組與秦皮甲素組均可降低線粒體膜電位。結(jié)果見表 4， 圖 1。

表4 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

表4 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

注: 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別綠色熒光細胞百分率/%生理鹽水組1.35 ±0.24順鉑組21.04 ±0.47**秦皮甲素組19.27 ±0.39**

3.5 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表達的影響 由圖2可知，順鉑組和秦皮甲素組與生理鹽水組比較，Bax蛋白表達增強而 Bcl-2 蛋白表達受到抑制。

圖 1 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響 （n=15）Fig.1 Effects of aesculin onm itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n=15）

4 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，多數(shù)學(xué)者認為，治療腫瘤最有效的途徑是直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的新靶點、新思路［7］。 中藥誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡是一個新興的課題，隨著其研究的不斷深入，對于揭示中藥的作用機制，篩選抗腫瘤新藥，均具有十分重要的意義［8］。

秦皮是常用中藥，秦皮甲素是中藥秦皮中的主要有效成分。通過體內(nèi)試驗我們發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生長，且呈劑量依賴性。

圖 2 秦皮甲素對肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表達的影響Fig.2 Effects of aescu lin on Bax and Bcl-2 p rotein of Lewis lung cancer xenografts in m ice

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與凋亡異常密不可分，所以研究能夠促進凋亡的抗癌藥物是目前腫瘤治療的主要手段之一。已知兩種信號途徑可以誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，即死亡受體途徑和線粒體途徑。在線粒體途徑中，線粒體膜電位降低是細胞凋亡的早期特征，通過體內(nèi)試驗，我們看到秦皮甲素可以使瘤組織的線粒體膜電位下降而誘導(dǎo)凋亡。線粒體在細胞凋亡中的重要性還在于它與 Bcl-2 基因家族的關(guān)系。 Bcl-2家族在線粒體途徑中起著重要的調(diào)控作用，它分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。通過檢測凋亡基因，我們發(fā)現(xiàn)秦皮甲素可以促進促凋亡蛋白 Bax的表達，抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達， 這進一步證實線粒體途徑是秦皮甲素誘導(dǎo)凋亡的重要機制［9-11］。

在細胞周期中， 最重要的調(diào)控點是 G1/S 調(diào)控點，細胞在該點分析細胞內(nèi)外的各種復(fù)雜信號以及DNA損傷情況， 以決定細胞是進入分裂程序 S期，還是處于靜止的 G0期。 通過流式細胞儀檢測， 表明秦皮甲素可將肺癌移植瘤小鼠腫瘤細胞周期阻滯于 S 期， 使其不能進入 G2/M期， 即不能正常進行細胞周期活動［12-15］。

綜上所述，秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生長，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)瘤細胞凋亡。但秦皮甲素在體內(nèi)外對肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附等方面是否有影響尚有待進一步深入研究。此外，秦皮甲素通過影響哪些通路、受體而發(fā)揮抗肺癌作用等均需要在以后的實驗中深入探討。

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Inhibitory effect of aesculin on m ice w ith Lew is lung cancer

WANG Jing

(First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Jinzhou， 121000， China)

AIM To explore the effect and mechanism of aesculin onmouse xenotransplanted Lewis lung cancer.METHODS Mouse Lewis lung cancer xenograft model was used to study the effect of aesculin on tumor growth.The tumor tissue was weighted to calculate the antitumor rate.Influence of aesculin on apoptotic genes Bax， Bcl-2 was determined byWestern blot.Distribution of tumor cell cycle and apoptotic cell death were analyzed by flow cytometry and mitochondrialmembrane potential JC-1 staining.RESULTS Aesculin inhibitedmouse lung tumor growth and tumor cell proliferation cycle and reduced the mitochondrialmembrane potential.Aesculin promoted Bax protein expression and at the same time lowered Bcl-2 protein expression in a dose dependentmanner. CONCLUSION Aesculin has a significant inhibition against the growth of mouse xenotransplanted Leise lung cancer， whose cycles are arrested at S phase.Aesculin could induce apoptosis through themitochondrial pathway.

Aesculin； Lewis lung cancer； mitochondrial pathway

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0249-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.007

2013-03-11

遼寧省自然科學(xué)基金項目 (2013022063)

王 晶 (1974—) ， 女， 主管藥師， 研究方向: 中藥抗腫瘤藥理。 Tel:15004162307， Email:wangjing2006050@126.com