金欣口服液對 RSV感染 BALB/c小鼠肺組織 TLR4 及 TAK1 表達(dá)的調(diào)控作用

李 濤， 汪受傳， 戴啟剛

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所， 江蘇 南京 210029）

金欣口服液對 RSV感染 BALB/c小鼠肺組織 TLR4 及 TAK1 表達(dá)的調(diào)控作用

李 濤， 汪受傳*， 戴啟剛

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所， 江蘇 南京 210029）

目的 通過觀察金欣口服液 (炙麻黃、 苦杏仁、 生石膏、 黃芩等) 對呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染肺組織TOLL樣受體 4(TLR4) 及轉(zhuǎn)化生長因子 β活化激酶 (TAK1) 表達(dá)的調(diào)控趨勢， 探討金欣口服液抗病毒機(jī)制以及TLR4 信號通路途徑。 方法 RSV滴鼻感染 BALB/c小鼠， 金欣口服液給藥進(jìn)行干預(yù)， 并于首次滴鼻后 24 h 取各組小鼠肺組織， Western Blot法檢測小鼠肺組織 TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)。 結(jié) 果 RSV感 染 BALB/c小鼠后 24h， TLR4 ﹑TAK1 蛋白表達(dá)明顯升高 (P＜0.01)， 而金欣口服液組較 RSV感染組 TLR4 ﹑ TAK1 表達(dá)明顯下調(diào) (P＜0.01)； 金欣組蛋白表達(dá)量最低， 與利巴韋林組相比， P＜0.01， 利巴韋林組與 RSV感染組相比 P＜0.01。 結(jié)論 金欣口服液能抑制 TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中 TLR4/TAK1 蛋白的表達(dá)， TLR4 的蛋白表達(dá)與 TAK1 的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)， 金欣口服液抗RSV作用機(jī)制中的 TLR4 信號通路途徑可能是通過 TAK1 實現(xiàn)的。

金欣口服液； 呼吸道合胞病毒； 肺組織； 小 鼠； TLR4； TAK1

金欣口服液 (原名清肺口服液) 是全國名老中醫(yī)汪受傳教授治療小兒病毒性肺炎的有效驗方。本課題組經(jīng)過前期的臨床及實驗研究已經(jīng)證實了金欣口服液對呼吸道合胞病毒 (RSV) 有抑制作用［1］，金欣口服液含藥血清能下調(diào) RSV活化誘導(dǎo)的 TLR3 及其下游炎癥因子 IL-6 的高表達(dá)， 推測其為金欣口服液抗 RSV感染的機(jī)制之一［2］。 趙霞等人研究證實金欣口服液在 RSV感染早期， 可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因拮抗其抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而影響進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制增殖過程，阻止病毒的擴(kuò)散［3］， 而且金欣口服液抗 RSV的機(jī)制可能與其通過上調(diào) RSV感染宿主體內(nèi) I型干擾素的表達(dá)， 從而發(fā)揮 I型干擾素的抗病毒效應(yīng)有關(guān)［4］。徐建亞等人通過實驗研究認(rèn)為金欣口服液含藥血清可以通過下調(diào) TLR4 和 TNF-α表達(dá)水平減輕感染 RSV后 Hep-2 細(xì)胞的病變程度［5］。 本實驗擬通過檢測金欣口服液對呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染 BALB/c小鼠24 h 后肺組織不同給藥的 TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步研究金欣口服液發(fā)揮抗病毒的作用機(jī)制以及 TLR4 信號通路途徑。

1 材料

1.1 動物與病毒 清潔級 BALB/c小鼠， 雌性18 ～22g(揚(yáng)州醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心， 生產(chǎn)許可證:2021430) 南 京 中 醫(yī) 藥 大 學(xué)， 使 用 許 可 證，SYXK(蘇)2005—0009； 呼吸道合胞病毒 A亞型Long株 (武漢國家典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.2 藥品與試劑 金欣口服液 (原名清肺口服液)， 方由炙麻黃 3 g、 苦杏仁 10 g、 生石膏 20 g、黃芩 6 g、 葶藶子 10 g、桑白皮 10 g、 前胡 10 g、虎杖12 g組成，上藥加水煎煮兩次， 其中生石膏加 10 倍量水先煎 30 min， 與此同時將剩余藥物在另一個容器中加 10 倍量水浸泡 30 min 后兩鍋合并， 大火煮沸， 小火繼續(xù)煎煮 1.5 h，藥液用 4 層紗布過濾，剩余藥渣加8倍量水，大火煮沸后小火繼續(xù)煎煮1 h， 4層紗布濾出藥液， 合并兩次藥液后靜置過夜，漏斗塾兩層棉花抽濾去除部分沉淀，濾出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低壓濃縮至1 L，得到質(zhì)量濃度為 1.351 g/L的金欣口服液。此次課題實驗所用金欣口服液由南京中醫(yī)藥大學(xué)植物藥與新藥開發(fā)研究中心 (江蘇省植物藥深加工工程中心) 制備；利巴 韋 林 注 射 液 (1 mL:0.1 g， 國 藥 準(zhǔn) 字H19999427， 南 京 金陵 藥 業(yè) 股 份 有 限 公 司；100 mg:1 m L， 南京金陵藥業(yè)股份有限公司)； 兔抗TLR4、 TAK1 多克降抗體 (Abcam， USA)； β-Actin、 羊抗兔 HRP標(biāo)志二抗 (美國 CST公司)； 蛋白裂解液 RIPA(增強(qiáng)型)、 PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司)； 29 ∶1 丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合物 (Acr-Bis)、 10%十二烷基磺酸鈉、 過硫酸銨(美國伯樂)；5 倍上樣緩沖液、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker(10 ～170 KD， 南京生興生物技術(shù)有限公司)； PVDF膜 (0.45 μm孔徑)， Millipore； 封口膜， Parafilm； 膠片 (柯達(dá)公司)；伊利牌脫脂奶粉 (伊利乳業(yè)有限公司)； 余為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗儀器材 高速臺式冷凍離心機(jī) Centrifuge 5810R； 電泳槽、Trans-Blot-SD半干轉(zhuǎn)印槽 ( 美國 Bio-rad)； EXL800 型 酶 標(biāo) 儀 ( 美 國 BioTek 公司)； 超 低 溫 冰 箱 ( 美 國 Theromo公 司)； RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)； 面包式離心機(jī)、 移液槍 (德國 Eppendorf公司)； 電子天平 (上海天平儀器廠)； 漩渦振蕩器、 水平搖床 (江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)； 制冰機(jī) (美國Scotsman 公司)； 紫外凝膠成像儀 Alphalmager HP (Alpha innotech， USA)。

2 方法與結(jié)果

2.1 RSV感染 BALB/c小鼠肺炎模型的制備及分組 健康 BALB/c小鼠， 常規(guī)飼養(yǎng)于無病原體環(huán)境中 3 d 后開始正式試驗。 RSV感染模型制備: 除正常組外，其余各組 BALE/c小鼠在乙醚淺麻后鼻腔滴注 100TCID50的 RSV懸液每只 50 μL( 每天滴鼻1次， 正常組給予相同劑量的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基)，待全部吸入鼻腔后放回籠中并記錄時間。將 BALB/c小鼠分為正常組、 RSV感染組、 利巴韋林組、 金欣中藥組 4 個小組 (n=5)。 藥物劑量:參照文獻(xiàn)［6］提供實驗動物和人臨床用藥劑量換算采用公式 d B=dA×RB/RA×

dB是欲求算的 B種動物 (包括人) 的千克體質(zhì)量劑量、 dA是已知 A種動物， 包括人的千克體質(zhì)量劑量； WA、 WB是已知動物 A、 B的體質(zhì)量；RB、 RA是 A、B動物的體型系數(shù)。

金欣口服液兒童臨床用量為 6 g/kg， 根據(jù)公式得出實驗 BALB/c小鼠的給藥劑量，金欣等效劑量為 27.6 g/(kg·d)(相當(dāng)于 2 歲兒童臨床等效劑量)， 利巴韋林兒童臨床用量為 10 mg/(kg·d)，根據(jù)公式得出 BALB/c小鼠利巴韋林給藥劑量為46 mg/(kg·d)(相當(dāng)于 2 歲兒童臨床等效劑量)； 每次 0.2 m L/10 g根據(jù)給藥量制備相應(yīng)濃度的藥物，正常組和 RSV感染模型組給予相同量的生理鹽水。給藥方式: 提前連續(xù)給藥3 d， 每天灌胃2次， 兩次間隔 8 h， 末次給藥后 2 h 進(jìn)行 RSV滴鼻， RSV首次滴鼻后24 h取樣品，在麻醉下處死小鼠開胸取肺組織， 其中肺左葉供 Western Blot實驗用， 分裝保存于液氮中， 全部取完后放入 -70 ℃冰柜中保存。

2.2 Western Blot法 檢 測 BALB/c小 鼠 肺 組 織TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá) 將組織從 -70 ℃冰箱中取出，并準(zhǔn)備一罐液氮，準(zhǔn)備研磨工具，將研磨過的肺組織裝入 1.5 ml Dolf管內(nèi)，并稱定質(zhì)量， 加入增強(qiáng)型 RIPA與 PMSF混合液 (兩者比例 100 ∶1) 加入混合液的量與組織的比為 5 ∶1，4 ℃下13 000 r/min離心 30 min， 取上清， 即為所提取之BALB/c小鼠肺組織總蛋白。 BCA法蛋白定量并根據(jù)結(jié)果調(diào)整使各樣品總蛋白含量一致，5倍上樣緩沖液蛋白變性， 5%濃縮膠及 10%分離膠 SDSPAGE凝膠電泳， PVDF膜轉(zhuǎn)印， 5%TBST脫脂奶粉封閉2 h， 1 ∶500 兔源性 TLR4、 TAK1 一抗 4 ℃孵育過夜、1 ∶5 000羊抗兔二抗孵育 2 h， ECL法顯色， 膠片壓片。 采用 Photoshop 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值， 以 β-actin 作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)， 采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值 /β-actin 條帶灰度值來表示蛋白相對表達(dá)水平。

2.4 結(jié)果

2.4.1 金欣口服液對 RSV感染 BALE/c小鼠肺組織 TLR4、TAK1 表達(dá)的影響 運(yùn)用 Western Blot法檢測 TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中 TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)水平， 結(jié)果如圖 1、 表 1 所示。 可見 RSV感染BALE/c小鼠后， TLR4、TAK1 蛋白的表達(dá)明顯升高 (P＜0.01)， 而金欣口服液則能降低 RSV感染后 TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)水平 (P＜0.01 或 P＜0.05)， 作用優(yōu)于利巴韋林組 (P＜0.01)， 同時TLR4、 TAK1 蛋白相對表達(dá)水平經(jīng)雙變量相關(guān)分析， Pearson 相關(guān)系數(shù) r=0.980 ﹑ P=0.000 提示兩者的蛋白表達(dá)呈正向直線相關(guān)。

圖 1 RSV感染 BALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白表達(dá)顯影圖Fig.1 Developing Fig of TLR4、 TAK 1 protein exp ression after BALB/cm ice infected w ith respiratory syncytia viru

表 1 RSV感染 B ALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白相對表達(dá)水平 （， n=5）Tab.1 Relative expression levels of TLR4、 TAK1 protein expression after BALB/cm ice infected with respiratory syncytia viru（， n=5）

表 1 RSV感染 B ALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白相對表達(dá)水平 （， n=5）Tab.1 Relative expression levels of TLR4、 TAK1 protein expression after BALB/cm ice infected with respiratory syncytia viru（， n=5）

注: 與 RSV感染組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與利巴韋林組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組 別TLR4/β-actinTAK1/β-actin正常組1.332 ±0.105▲▲0.526 ±0.006▲▲RSV感染組1.815 ±0.1210.847 ±0.033利巴韋林組1.125 ±0.078▲▲0.370 ±0.018▲▲金欣口服液組0.768 ±0.097▲▲**0.120 ±0.005▲▲**

3 討論

呼吸 道 合 胞 病 毒 (respiratory syncytial viral，RSV) 是有包膜非片段性的單股負(fù)鏈 RNA病毒，是導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染最為重要的病毒病源［7］， 而 RSV在活化誘導(dǎo) TOLL樣受體 (Toll-like receptors， TLRs) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演著重要的角色［8］， 人 體 中 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 11 個 TLRS 成 員， 其 中TLR4 是 與 RSV 關(guān) 系 最 為 密 切 的 TLRs之 一［9］，TLR4 作為病毒包膜糖蛋白的識別對象， RSV的融合蛋白 (F) 是活化 TLR4 的病毒成分［10］。 在 RSV感染的上皮細(xì)胞的過程中， TLR4 通過引起 LPS 介導(dǎo)的 IL-6 反應(yīng)而起到重要作用， 而且很可能是影響上皮細(xì)胞趨化因子與病毒和內(nèi)毒素相互作用的一個重要因素，這和 RSV疾病的表型有關(guān)［10］。 除了通過 MyD88 依賴性信號途徑誘導(dǎo) NF-K B活化和炎癥細(xì)胞因子的分泌外， TLR4 也可通過 TRIF/TRAM依賴性信號通路， 激活由脂多糖 (LPS) 介導(dǎo)所致的各種細(xì)胞炎癥反應(yīng)［11］。 TOLL樣受體家族在調(diào)節(jié)機(jī)體天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中扮演著重要角色， TLR4 信號通路途徑又是與 RSV關(guān)系最為密切的。 穩(wěn)態(tài)下， 機(jī)體存在 TLRs的復(fù)性調(diào)節(jié)， 適時終止 TLRS 信號通路， 避免過強(qiáng)的免疫反應(yīng)。 如可溶性 TLR4(sTLR4) 競爭相應(yīng)的配體、 細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子 (SOSC1) 通過抑制 IRAK活性，加速 MyD88 樣轉(zhuǎn)接蛋白 (Mal， 也稱 TIRAP) 的降解、 胞漿鋅脂蛋白 (A20) 將 TRAF6 去泛素化等途徑調(diào)控 TLR4 的信號通路［12］。 TRAF6 活化轉(zhuǎn)化生長因子 β活化激酶 (TAK1)， 后者激活 IκB激酶 (IKKs， 包括 IKKα、 IKKβ、 IKKγ)， 進(jìn)而活化NF-κB。當(dāng) NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，從而促進(jìn) TNF-α、 IL-6、 IL-8、 IL-12 等細(xì)胞因子的表達(dá)； 我們推測， 金欣口服液可能通過調(diào)控 RSV誘導(dǎo)活化的 TLRs信號通路來間接發(fā)揮抗病毒作用，起作用靶點可能存在于 TLRs或其信號通路中， 而 TAK1 是其信號通路中重要的銜接蛋白之一， 從而發(fā)揮抗 RSV感染所致的炎癥反應(yīng)。 本課題組通過 Western Blot實驗方法， 研究金欣口服液對呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染 BALB/c小鼠 24 h 后肺組織不同給藥的 TLR4、TAK1 的蛋白表達(dá)水平， 從而進(jìn)一步研究金欣口服液發(fā)揮抗病毒的作用機(jī)制以及 TLR4 信號通路途徑。以及進(jìn)一步探索該中藥的作用靶點和分子機(jī)制。 結(jié)果發(fā)現(xiàn):RSV感染 BALB/c小鼠后 24 h，TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)與正常組比較明顯升高(P＜0.01)， 而金欣口服液組較 RSV感染組 TLR4、TAK1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào) (P＜0.01)； 金欣中藥組能同時降低 RSV感染后 24 h TLR4、 TAK1 蛋白表達(dá)水平 (與 RSV感染組相比， P＜0.01) 金欣中藥組蛋白表達(dá)量最低，與利巴韋林組相比，P＜0.01， 利巴韋林組與 RSV感染組相比 P＜0.01。

綜上所述金欣口服液能抑制 TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中 TLR4/TAK1 蛋白的表達(dá)， 而 TLR4 的蛋白表達(dá)與 TAK1 的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)， 也就是說金欣口服液發(fā)揮抗 RSV作用機(jī)制中的 TLR4 信號通路途徑可能 是 通 過 TAK1 來 發(fā) 揮 作 用 的， 即 TLR4/ MyD88/TAK1/NF-κB/TNF-α途徑， 我們將進(jìn)一步研究 TLR4 信號通路的其它可能作用靶點， 采用更多的實驗技術(shù)如激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、ELISA、 免疫熒光等實驗技術(shù)以及采用不同給藥時間如 48 ﹑ 72 ﹑ 144 h 等來提供更加有力的證據(jù)，從而進(jìn)一步揭示出金欣口服液可能的抗 RSV感染途徑。

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Effect of Jinxin Oral Liquid on expression of lung TLR4 and TAK 1 of BALB/c m ice infected with RSV

LITao， WANG Shou-chuan*， DAIqi-gang
(Institute of Pediatrics of ChineseMedicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China)

AIM To study the effect of Jinxin Oral Liquid(Ephedrae Herba， Armeniacae Semen amarum， Gypsum fibrosum，Scutellariae Radix，etc.)on the expression of Toll-like receptor4(TLR4)and TAK1 ofmice lung tissues infected with respiratory syncytial virus(RSV)and explore Jinxin Qral Liguid's anti-viral mechanism and TLR4signal path.METHODS BALB/c mice were intranasally inoculated with RSV， and then treated with Jinxin Oral Liquid.After 24 hours of inoculated with RSV， themice were killed and the lung sampleswere collected， and then the expression of TLR4 and TAK1 wasmeasured by Western Blot.RESULTS The results demonstrated that after being infected twenty-four hours， the expression of TLR4 and TAK1 were up-regulated significantly(P＜0.01)， but in oral liquid group were down-regulated compared with the RSV infected group(P＜0.01).The level of protein expression in Jinxin group was the lowest， compared with that in Ribavirin group(P＜0.01) ， and the Ribavirin group compared with the RSV infected group(P＜0.01).CONCLUSION Jinxin Oral Liquid can inhibit the expression of TLR4/TAK1 in signal transducing pathway of TLR4 in a positive correlation between TLR4 and TAK1， the antiviralmechanism of TLR4'signal transducing pathwaymay be related to TAK1.

Jinxin Oral Liquid； respiratory syncytial virus(RSV)； lung tissue； mice； TLR4、 TAK1

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0225-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.002

2013-03-21

國家自然科學(xué)基金 (81072840)； 高校博士點專項科研基金 (201003237110003)

李 濤 (1987—)， 男， 碩士生， 從事小兒肺系疾病的研究。

*通信作者: 汪受傳， 男， 教授， 研究方向: 小兒肺系疾病的研究。 Tel:(025)86798182， E-mail:wscnj@126.com