HPLC法同時測定燒傷膏中沒食子酸、 蘆薈大黃素、 大黃素和大黃酚

王艷坤， 趙 萍， 高 建1，*， 黃趙剛， 高昌琨， 夏 泉， 許杜娟1，*

（1.安徽醫(yī)科大學藥學院， 安徽 合肥 230032； 2.合肥市第一人民醫(yī)院 （西區(qū)） 藥劑科， 安徽 合肥230031； 3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部， 國家中醫(yī)藥管理局中藥化學三級實驗室 TCM-2009-202，安徽 合肥 230022；4.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230038）

HPLC法同時測定燒傷膏中沒食子酸、 蘆薈大黃素、 大黃素和大黃酚

王艷坤1，2， 趙 萍3，4， 高 建1，3，4*， 黃趙剛3， 高昌琨3， 夏 泉3， 許杜娟1，3*

（1.安徽醫(yī)科大學藥學院， 安徽 合肥 230032； 2.合肥市第一人民醫(yī)院 （西區(qū)） 藥劑科， 安徽 合肥230031； 3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部， 國家中醫(yī)藥管理局中藥化學三級實驗室 TCM-2009-202，安徽 合肥 230022；4.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230038）

目的 建立同時定量測定燒傷膏 （大黃、地榆、五倍子等） 中沒食子酸、 蘆薈大黃素、 大黃素及大黃酚的高效液相色譜方法。 方法 Diamonsil-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相為甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫， 檢測波長254 nm； 柱溫 30 ℃； 體積流量 1.0mL/min。 結(jié)果 沒食子酸在 0.061 1 ～0.488 5mg/mL（r=0.999 2）， 蘆薈大黃素在0.008 4 ～0.067 5mg/mL（r=0.999 3）， 大黃素在 0.010 9 ～0.087 0mg/mL（r=0.999 7）， 大黃酚在 0.073 9 ～0.590 8 mg/mL（r=0.999 4） 范圍內(nèi)線性關系良好； 平均加樣回收率分別為 98.50%、 98.15%、 97.89%及 97.52%， 其 RSD值（n=6） 分別為0.43%、 1.50%、 2.00%， 0.28%。 結(jié)論 本方法準確、 可靠、 簡便， 重復性好， 適合燒傷膏中鞣質(zhì)及蒽醌類物質(zhì)的測定。

燒傷膏； HPLC； 沒食子酸； 蒽醌類化合物

燒傷是由多種原因?qū)е碌臋C體復雜外傷性疾病，分為熱力燒傷、 電 （流） 燒傷、 化學 （性） 燒傷和放射 （性）燒傷，臨床上習慣所稱的 “燙傷” 也是熱力燒傷的一種［1］。 在燒傷治療中存在著創(chuàng)面疼痛、 進行性壞死、 易感染、 瘢痕愈合四大難題［2］。 目前研究表明， 中藥的治療優(yōu)勢明顯［3］。 燒傷膏是一種燒傷治療特色制劑， 由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院于上世紀七十年代研制成功，具有清熱解毒、活血化瘀、澀經(jīng)止血、生肌斂瘡之功效，臨床上適用于各種燒燙傷的治療，經(jīng)藥理實驗和臨床實踐證實效果顯著［4］。 但是由于其為中藥復方制劑， 成分復雜， 質(zhì)量控制標準制定難度較大，因此制約了其進一步的推廣使用。

燒傷膏由大黃、地榆、五倍子、爐甘石、赤石脂和冰片等藥材熬制而成，其中大黃中含有的蒽醌類物質(zhì)在燒傷的治療中主要有抗菌、 消炎、 促進傷口愈合等作用［5］。 而地榆和五倍子中含有的鞣質(zhì)類成分，則對傷口有很好的收斂作用，能夠同創(chuàng)面的滲出液結(jié)痂，以防止外來細菌的有害入侵， 促進傷口愈合［6］。 所以， 為了規(guī)范該制劑的生產(chǎn)以及進一步的推廣使用，本實驗選取制劑大黃中蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及地榆、五倍子中的鞣質(zhì)類成分沒食子酸為代表作為燒傷膏質(zhì)量控制的量化指標，進行定量測定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀 （ Waters e2695， 美國） ， Diamonsil C18（ 4.6 mm ×250 mm， 5 μm， 迪 馬 科 技 公 司 ）；SB3200 超聲清洗機 （必能信超聲儀器公司）； 電熱恒溫水浴鍋 （上海醫(yī)療器械五廠）； AB135-S 電子分析天平 （ 梅特勒 -托利多中國地區(qū)生產(chǎn)）； 低速離心機 （飛鴿牌）。

1.2 試劑 燒傷膏 （安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院制劑中心， 批號分別為 20130823、 20131002、 20131121）； 滅菌注射用水 （四川科倫藥業(yè)股份有限公司）； 定量測定用沒食子酸對照品 （ 批 號 110831-200302）、 蘆薈 大 黃 素 （ 批號110795-201007） 、 大 黃 素 （ 批 號 110756-200110 ） 、 大 黃 酚（批號 110776-200615） 均來源于中國藥品生物制品檢定所。甲醇 （色譜純， TEDIA公司）； 85%磷酸 （分析純， 上海振企化學試劑有限公司）； 濃硫酸 （分析純， 無錫市展望化工試劑 有限公 司）； 石油 醚 （分析純， 沸程為 60 ～90 ℃， 西隴化工股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條 件 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm，迪馬科技公司）； 流動相為甲醇 （A） -0.1%磷酸 （B） 系統(tǒng)梯度洗脫 （0 min， 10%A； 0 ～15min， 10% ～50%A； 15 ～30 min， 50%～85%A； 30 ～50 min， 85%A） 。 進樣量 20 μL；檢測波長 254 nm； 體積流量 1.0 mL/min； 柱溫 30 ℃。 在此色譜條件下，理論塔板數(shù)按沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素、 大黃酚計算均不低于4 000， 分離度均大于 1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取各對照品， 精密稱定得沒食子酸 9.77mg， 蘆薈大黃素 1.35 mg， 大黃素 1.74 mg， 大黃酚 11.82 mg， 分別加入甲醇完全溶解后 （超聲助溶），定容于 5 m L量瓶中， 制備成含沒食子酸 1.954 0 mg/mL，蘆薈大黃素 0.270 0mg/mL， 大黃素 0.348 0 mg/mL， 大黃酚 2.363 2 mg/mL的對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取燒傷膏約 10 g， 精密稱定，用甲醇提取 2 次， 每次 50 mL各超聲 20 min， 過濾， 合并濾液于60 ℃下水浴， 揮干溶劑后加甲醇定容至 5 mL得溶液 A。 濾渣加 70 mL 20%硫酸， 超聲 20 min 酸化后， 用石油醚提取 2 次， 分別加 70 mL、 45 m L各超聲 15 min， 合并兩次石油醚溶液， 于 60 ℃下?lián)]干溶劑， 加甲醇定容至10 mL得溶液 B。 將溶液 A和溶液 B混勻后， 用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方及工藝制備不含大黃、 地榆與五倍子的陰性樣品， 再按 “2.2.2” 項下制備成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性考察 使用 “2.1” 項下色譜條件， 對混合對照品及樣品溶液進行 HPLC分析， 通過對比樣品溶液色譜圖與對照品溶液色譜圖，發(fā)現(xiàn)樣品中沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素及大黃酚的保留時間與對照品一致，且分離效果良好， 如圖1。

圖1 樣品及對照品溶液 HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察 精密量取沒食子酸、 蘆薈大黃素、 大黃素、 大黃酚對照品貯備液各1 mL混合并定容， 其中沒食子酸 0.488 5 mg/mL； 蘆薈大黃素 0.067 5 mg/mL； 大黃素0.087 0 mg/mL； 大黃酚 0.590 8 mg/mL。 將此混合對照品溶液稀釋為不同質(zhì)量濃度： 沒食子酸 （0.488 5、 0.244 3、 0.122 1、 0.081 4、 0.061 1mg/mL）； 蘆薈大黃素 （0.067 5、0.033 8、 0.016 9、 0.011 2、 0.008 4 mg/mL）； 大 黃 素（0.087 0、 0.043 5、 0.021 8、 0.014 5、 0.010 9 mg/mL）；大黃酚 （0.590 8、 0.295 4、 0.147 7、 0.098 5、 0.073 9 mg/mL）。 依次將以上對照品混合溶液在 “2.1” 項色譜條件下， 進樣 20 μL， 測定峰面積， 以峰面積為縱坐標 （Y），質(zhì)量濃度 （mg/mL） 為橫坐標 （X）， 繪制標準曲線， 計算其回歸方程及線性范圍， 沒食子酸為 Y=41 253 968.289 3 X-662 302.396 8 （r=0.999 2）， 線性范圍為 0.061 1 ～0.488 5 mg/mL； 蘆 薈 大 黃 素 為 Y=29 905 947.680 2 X-531 07.075 8 （r=0.999 3）， 線性范圍為 0.008 4 ～0.067 5 mg/mL； 大 黃 素 為 Y=83 648 643.815 5 X-66 892.088 7（r=0.999 7）， 線性范圍為 0.010 9 ～0.087 0 mg/mL； 大黃酚為 Y=15 070 819.028 4X-259 854.572 0 （r=0.999 4），線性范圍為 0.073 9 ～0.590 8 mg/mL。 均呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取供試品溶液 20 μL連續(xù)進樣6次，分別測定沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素及大黃酚面積， 計算其相對標準偏差 （RSD）。 RSD值分別為 0.81%、0.99%、 0.95%和 1.34%， 結(jié)果表明， 儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別在第 0、 2、 4、 6、12、 24 h 按 “2.1” 項下色譜條件進樣， 測定樣品中沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素及大黃酚的峰面積，計算其相對標 準 偏 差 （ RSD）。 RSD 值 分 別 為 0.87%、 1.39%、0.86%和 0.91%， 表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 取同一批號 （批號 20130823） 燒傷膏樣品， 按 “2.2.2” 項下平行制備 6 份供試 品溶液， 按“2.1” 項下色譜條件測定沒食子酸、 蘆薈大黃素、 大黃素和大黃酚的峰面積并計算其相對標準偏差 （RSD）。 RSD值分別為 1.41%、 1.73%、 2.90%、 2.28%， 均 小 于 3%，說明制劑提取方法重復性較高。

2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含有量的同一批次樣品（批號 20130823） 約 5 g， 精密稱定 6 份， 分別精密加入新配置的對照品混合溶液 5 mL， 其中沒食子酸 1.30 mg， 蘆薈大黃素 0.13 mg， 大黃素 0.11 mg， 大黃酚 1.20 mg。 按“2.2.2” 項下平行制備 6 份供試品溶液， 按 “2.1” 項下色譜條件測定沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的峰面積并計算加樣回收率， 結(jié)果如表1。

2.9 樣品的測定 取燒傷膏樣品 3 批次， 按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 按 “2.1” 項下色譜條件進行測定并計算，具體結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶媒及方法的選擇 本方法中 4 個指標成分的溶解性不同，其中鞣質(zhì)類的沒食子酸成分在極性大的溶劑中溶解性較強， 經(jīng)預實驗多次驗證， 選用 50 mL甲醇提取率較高，而蒽醌類的蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚為脂溶性，故在預實驗中采用三氯甲烷和石油醚作為提取溶劑，提取前先酸化處理，目的增加游離蒽醌含量，提高提取率。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)三氯甲烷和石油醚提取率相當，故選用毒性較小的石油醚作為提取溶劑。在提取方法的選擇上，參閱相關文獻［7-8］比較發(fā)現(xiàn)其中超聲提取法操作簡便快速， 因無需加熱，較少改變成分復雜的中藥制劑的有效成分且所需試樣量少、消耗溶劑較少，故選用此法。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

表 2 3 批燒傷膏樣品測定結(jié)果 （mg·g-1， n=3）

3.2 流動相的選擇 本實驗所選擇的定量指標沒食子酸與蒽醌類成分中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚極性相差較大，采用 《中國藥典》［9］測定其中某一指標成分的流動相體系無法同時對此4種成分進行有效的分離測定。本色譜條件中的流動相體系是在多次預實驗與文獻 ［10-11］ 的基礎上建立的， 采用甲醇-0.1%磷酸進行梯度洗脫， 對燒傷膏中此4種指標成分的分離度好，并能同時測定其含有量。

3.3 小結(jié) 本實驗所建立的定量測定方法， 采用同一色譜條件對中藥復方制劑燒傷膏中兩類物質(zhì)四個主要成分同時進行測定，操作簡便，節(jié)約成本，能有效提高分析效率，此法可作為燒傷膏的質(zhì)量控制方法。

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R927.2

： B

： 1001-1528（2014）05-1095-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.051

2013-12-28

國家自然科學基金面上項目 （81173632）； 安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項目 （2012zy52）； 安徽省省級中醫(yī)藥發(fā)展專項基金特色中藥制劑研發(fā)項目 （2013）； 安徽省高等教育振興計劃人才項目省學術帶頭人培養(yǎng)資助 （2013）

王艷坤 （1985—）， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥復方制劑質(zhì)量控制。 Email： ahhfwyk@126.com

*通信作者： 高 建 （1976—）， 男， 博士， 副主任藥師， 副教授， 碩士生導師， 研究方向： 中藥復方藥效物質(zhì)基礎、 呼吸藥理學。Tel：（0551）62922423， E-mail： gaojianayfy@163.com許杜娟 （1963—）， 女， 博士， 主任藥師， 副教授， 碩士生導師， 研究方向： 中藥復方藥效物質(zhì)基礎、 臨床藥學。 Tel：（0551）62922442， E-mail： xudujuan6365@163.com