補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后在 “二神丸” 中對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉小鼠的止瀉研究

潘 新， 胡昌江， 耿媛媛， 趙 玲， 吳珊珊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后在 “二神丸” 中對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉小鼠的止瀉研究

潘 新， 胡昌江*， 耿媛媛， 趙 玲， 吳珊珊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

目的 探討補(bǔ)骨脂、 肉豆蔻生品與炮制品分別配方組成的古方 “二神丸” 對(duì) “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 小鼠止瀉作用的差異， 以闡明炮制對(duì)方劑療效影響。 方法 設(shè)立空白組、 陽(yáng)性藥物組、 “二神丸” Ⅰ （補(bǔ)骨脂生品 +肉豆蔻生品）、“二神丸” Ⅱ （補(bǔ)骨脂生品 +肉豆蔻煨制品）、 “二神丸” Ⅲ （補(bǔ)骨脂鹽炙品 +肉豆蔻生品）、 “二神丸” Ⅳ （補(bǔ)骨脂鹽炙品 +肉豆蔻煨制品） 共6組， 觀察對(duì)番瀉葉所致小鼠急性腹瀉以及氫化可的松和大黃造成的 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉”模型小鼠泄瀉的影響。 結(jié)果 “二神丸” Ⅲ、 Ⅳ組的小腸推進(jìn)率與空白組相比有顯著性差異 （P＜0.05）； “二神丸”Ⅳ組的首次泄瀉時(shí)間、 稀便率、 稀便級(jí)和腹瀉指數(shù)與空白組比較， 均有極顯著性差異 （P＜0.01）。 結(jié)論 “二神丸”Ⅳ組的止瀉作用優(yōu)于其他組合，即鹽炙補(bǔ)骨脂和煨炙肉豆蔻組方的 “二神丸” 止瀉作用增強(qiáng)。

“二神丸”； 脾腎陽(yáng)虛泄瀉； 炮制品； 止瀉作用

辨證施治、復(fù)方入藥、飲片炮制是中醫(yī)用藥的三大特色。本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后分別組成的復(fù)方“二神丸” 進(jìn)行研究， 充分體現(xiàn)復(fù)方入藥、飲片炮制的中醫(yī)用藥特色，緊密結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的實(shí)際，突出其研究實(shí)用性。

“二神丸” 出自宋·許叔微的《普濟(jì)本事方》， 以補(bǔ)骨脂和肉豆蔻組成，具有溫腎暖脾，澀腸止瀉之功效，是臨床治療五更泄瀉的基礎(chǔ)方，而脾腎陽(yáng)虛是引起五更泄瀉的主要病機(jī)［1］。 補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)、 固精縮尿、 溫脾止瀉的作用［2］， 在 “二神丸” 中補(bǔ)骨脂需鹽炙， 以增強(qiáng)溫腎暖脾止瀉作用［3］（在前期研究中已證明這一點(diǎn)）； 肉豆蔻溫中行氣， 澀腸止瀉之效［4］， 原方中肉豆蔻用生品， 但現(xiàn)代有研究表明單味生肉豆蔻有滑腸之弊，通過煨制后，可免于滑腸， 并增強(qiáng)固腸止瀉作用［5-6］， 也有研究認(rèn)為， 肉豆蔻生品即有顯著的止瀉作用而炮制不能增強(qiáng)肉豆蔻止瀉作用，故不用炮制［7］。 《中囯藥典》 2010 年版一部 “四神丸” 中肉豆蔻用煨制品 （ “四神丸” 是 “二神丸” 基礎(chǔ)上加吳茱萸、 五味子而成， 主治范圍十分接近）。 在古方應(yīng)用上使用炮制品有所區(qū)別，復(fù)方 “二神丸” 中肉豆蔻是否需要煨制，亦缺乏炮制機(jī)理闡述。因此，通過本實(shí)驗(yàn)的研究，將解決補(bǔ)骨脂、 肉豆蔻在 “二神丸” 中炮制入藥理由， 為指導(dǎo)臨床合理用藥，提高方劑療效具有重要的實(shí)際意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 補(bǔ)骨脂生品， 購(gòu)于成都市藥材市場(chǎng)， 經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室盧先明教授鑒定，為豆科植物補(bǔ)骨脂 Psoralea coryli folia L.的干燥成熟果實(shí)。

補(bǔ)骨脂鹽炙品：取補(bǔ)骨脂藥材，加入藥材量一半的2%食鹽水， 室溫悶潤(rùn) 24 h， 于 150 ℃炒制 10min 后置托盤中于30℃鼓風(fēng)烘箱中烘干。

肉豆蔻生品：購(gòu)于成都市藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室盧先明教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻 Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。

肉豆蔻煨炙品： 取肉豆蔻生品與麥麩 （100 g∶40 g）同置鍋內(nèi)， 文火加熱， 溫度控制在 130 ～150 ℃， 翻炒20 min， 至麥麩呈焦黃色， 肉豆蔻呈棕褐色 （據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肉豆蔻麩炒止瀉效果優(yōu)于面裹煨、紙裹煨、滑石粉煨，故直接用麩煨制［5］）。

“二神丸” Ⅰ： 補(bǔ)骨脂生品 +肉豆蔻生品 （20 g∶10 g）。

“二神丸” Ⅱ： 補(bǔ)骨脂鹽炙品 +肉豆蔻生品 （20 g∶10 g）。

“二神丸” Ⅲ： 補(bǔ)骨脂生品 +肉豆蔻煨炙品 （20 g∶10 g）。

“二神丸” Ⅳ： 補(bǔ)骨脂鹽炙品+肉豆蔻煨炙品 （20 g∶10 g）。

將四種組合的 “二神丸” 先用 75%乙醇回流提取， 藥渣再加水煎煮， 合并藥液， 濃縮， 配制成 0.5 g/mL藥液備用。

易蒙停藥液 （西安楊森制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)110901627）： 從膠囊中取出一定量藥粉， 加蒸餾水配制成0.04mg/mL的藥液。

參苓白術(shù)丸 （山東方健制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20120515） 混懸液： 取一定量藥丸， 加蒸餾水均勻混合配制成 0.5 g/mL的混懸液。

番瀉葉水煎液 （藥材購(gòu)于成都市藥材市場(chǎng)）： 加水煮沸約 10 min 后用二層紗布過濾， 濾液減壓濃縮成 0.3 g/mL的藥液。

大黃混懸液 （藥材購(gòu)于成都市藥材市場(chǎng)）： 取一定量細(xì)粉制成 0.25 g/mL混懸藥液。

氫化可的松注射液 （天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司， 產(chǎn)品批號(hào) 1103052）， NaCl注射液 （四川科倫藥業(yè)股份有限公司， 產(chǎn)品批號(hào) M12011117）。

1.2 儀器 小鼠灌胃器、 1 mL一次性無菌注射器、 自制小鼠代謝籠 （實(shí)用新型專利， 專利號(hào)： CN201146735）、 濾紙、 計(jì)時(shí)手表， 電子天平 （ 德國(guó) Sartorius公司） 。

1.3 動(dòng)物 昆明種健康小鼠 （普通級(jí)）， 體質(zhì)量 18 ～22 g，雄性， 成都達(dá)碩生物科技有限公司提供， 合格證號(hào) SCXK（川） 2013-24。

1.4 試驗(yàn)場(chǎng)所 成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制實(shí)驗(yàn)室 （國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室）； 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室， 許可證號(hào)： 川實(shí)動(dòng)管使第15號(hào)。

2 方法

2.1 造模及給藥 在中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中， 建立合適的動(dòng)物模型非常重要，經(jīng)過多年的研究探索，已經(jīng)出現(xiàn)了較多的脾陽(yáng)虛和腎陽(yáng)虛的造模方法，但是對(duì)脾陽(yáng)虛與腎陽(yáng)虛同時(shí)發(fā)病，即脾腎陽(yáng)虛證的造模方法報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期對(duì)腎陽(yáng)虛和脾陽(yáng) 虛小鼠 模型研究基 礎(chǔ) 上［8-10］， 并參照 《醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型——制作與應(yīng)用》、 《中藥藥理研究方法學(xué) （ 第二版） 》 等 藥理學(xué)研究 工具書［11-13］， 確定了造模方法，即氫化可的松及大黃復(fù)合造模致小鼠 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉”模型。

取健康雄性小鼠20只， 隨機(jī)分為2組， 空白組與模型組， 每組各10只。 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后， 均無異常表現(xiàn)即納入實(shí)驗(yàn)，用苦味酸標(biāo)記，稱定質(zhì)量。空白組每天注射等體積的 NaCl注射液， 模型組動(dòng)物每天按 0.1 m L/10 g體質(zhì)量臀部皮下注射氫化可的松注射液， 連續(xù)7 d， 從第 8天開始， 模型組停止注射氫化可的松， 用大黃灌胃至第 14天。記錄動(dòng)物從第1天至第15天的體質(zhì)量、 飲食飲水量， 外觀和行為狀況。

2.1.1 一般外觀行為狀況 造模組動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少、 反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、 體毛枯疏等情況，在造模2～3天后相繼出現(xiàn)軟稀便， 第4～6天出現(xiàn)溏泄， 且部分小白鼠有不同程度的脫肛、腹部腫脹的情況?？瞻捉M動(dòng)物則無異常表現(xiàn)。

2.1.2 體質(zhì)量及飲食飲水變化狀況 觀察第 1 ～15 天空白組與模型組小鼠的平均體質(zhì)量變化與平均每只小鼠每日的攝食及攝水的情況， 結(jié)果見表1 ～2。

由表1 ～2 可觀察到在第1 ～15 天， 空白組小鼠的體質(zhì)量每日都有所增長(zhǎng)且增長(zhǎng)幅度較大，而模型組小鼠在第1～7天時(shí)有略微增重，從第8天開始體質(zhì)量急劇下降；空白組小鼠的飲食量也是每日有所增加，模型組在造模的1～6 d 飲食量基本保持在平穩(wěn)狀態(tài)， 7 ～10 d飲食量有所減少，第10天后基本保持穩(wěn)定； 空白組和模型組的飲水量變化趨勢(shì)基本相同，但模型組的飲水量始終低于空白組。

表1 氫化可的松及大黃致 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 小鼠體質(zhì)量變化情況

表2 氫化可的松及大黃致 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 小鼠飲食飲水量變化情況

2.1.3 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)中， 模型組小鼠通過注射氫化可的松和大黃灌胃后相繼出現(xiàn)的溏泄脫肛，腹部腫脹，體質(zhì)量減輕等癥狀與中醫(yī)理論中的 “ 脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 相符［14-15］， 因此認(rèn)為此種方法得到的 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 模型造模成功。

2.2 “二神丸” 對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉小鼠腸推進(jìn)率的影響取小鼠 60 只， 按體質(zhì)量隨機(jī)分為 6 組， 每組 10 只。 除正常組外， 其他各組按 “2.1” 項(xiàng)下方法造模， 造模 14 d 后，按以下方式給藥： 陽(yáng)性組按 0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌以參苓白術(shù)丸混懸液， 給藥組分別按 0.2mL/10 g體質(zhì)量灌以 4 種組合的 “二神丸” 藥液，空白組灌以同等體積的水， 連續(xù)6 d， 第 6 天給藥后禁食不禁水 12 h， 第 7 天以一定量活性炭混勻于藥物中給各組小鼠灌胃， 20 min 后斷頸處死， 剖腹取出從幽門回部至回盲部的全部小腸，剪去腸系膜，將小腸輕輕拉直，平鋪于白紙上，測(cè)量并記錄墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度，計(jì)算墨汁推進(jìn)百分率。結(jié)果見表3。

表3 四種組合 “二神丸” 對(duì) “脾腎陽(yáng)虛” 模型小鼠小腸推進(jìn)影響

由表3可見， “二神丸” Ⅲ、 Ⅳ組以及陽(yáng)性組的小腸推進(jìn)率與空白組相比有顯著性差異 （P＜0.05）， 說明 “二神丸” Ⅲ、 Ⅳ組對(duì) “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 小鼠的腹瀉有明顯的改善作用。

2.3 “二神丸” 對(duì)番瀉葉所致小鼠急性腹瀉的止瀉作用

取小鼠 60 只， 按體質(zhì)量隨機(jī)分為 6 組， 每組 10 只， 實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水 12 h。 空白組灌蒸餾水； 陽(yáng)性組按 0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌易蒙停藥液； 給藥組分別按 0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌以四種組合的 “二神丸” 藥液； 灌胃后 30 min 各組均灌番瀉葉 0.2 m L/10 g， 隨后將小鼠置墊濾紙的自制小鼠代謝籠中， 觀察小鼠稀便點(diǎn)數(shù)， 連續(xù)觀察5 h， 各組數(shù)據(jù)采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果見表 4。

表4 四種組合 “二神丸” 對(duì)番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響

觀察指標(biāo)［16］： ①稀便率： 每只動(dòng)物所排稀便數(shù)與總便數(shù)之比。②稀便級(jí)：表示稀便的程度。以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級(jí)。 分為四級(jí)， 標(biāo)準(zhǔn)： 級(jí)數(shù) （污染直徑 cm）： 1 （ ＜1）； 2 （1 ～1.9）； 3 （2 ～3）； 4 （ ＞3）。 統(tǒng)計(jì)時(shí)先逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每一堆稀便的級(jí)數(shù)，然后將該鼠所有稀便級(jí)數(shù)相加除以稀便次數(shù)得稀便的平均級(jí)數(shù)。③腹瀉指數(shù)：稀便率與稀便級(jí)的乘積。

2.4 結(jié)果 由表 4 可見， “二神丸” Ⅳ組的首次泄瀉時(shí)間、稀便率、稀便級(jí)和腹瀉指數(shù)與空白組比較，均有極顯著性差異 （P＜0.01）， 說明 “二神丸” Ⅳ組可明顯延長(zhǎng)番瀉葉所致急性腹瀉小鼠的首次泄瀉時(shí)間，降低稀便率、稀便級(jí)和腹瀉指數(shù)。

3 討論

“二神丸” 乃治療脾腎虛寒， 五更泄瀉的傳統(tǒng)古方， 文獻(xiàn)資料多為對(duì)該方組成藥物補(bǔ)骨脂、肉豆蔻的單味藥物研究，鮮見復(fù)方的研究，且少數(shù)對(duì)復(fù)方的研究忽略了其組方中藥物炮制品的臨床藥效，因此本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)骨脂生品、補(bǔ)骨脂鹽炙品、肉豆蔻生品、肉豆蔻煨炙品兩兩組合配方，得到四種組合的 “二神丸”， 以 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 和急性腹瀉的動(dòng)物模型為研究對(duì)象，考察小鼠小腸推進(jìn)率、首次泄瀉時(shí)間、稀便級(jí)、稀便率以及腹瀉指數(shù)為指標(biāo)，確定止瀉效果最佳的一種 “二神丸” 組合。

通過實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果顯示， “二神丸” Ⅲ、 Ⅳ組對(duì)“脾腎陽(yáng)虛泄瀉” 小鼠有明顯的止瀉作用， 且 “二神丸”Ⅳ組可明顯延長(zhǎng)番瀉葉所致急性腹瀉小鼠的首次泄瀉時(shí)間，降低稀便率、稀便級(jí)和腹瀉指數(shù)。 綜合考慮，確定了 “二神丸”Ⅳ組的止瀉作用優(yōu)于其他組合，提示了 “二神丸”中藥物補(bǔ)骨脂和肉豆蔻分別經(jīng)過鹽炙和煨炙后止瀉作用有所增強(qiáng)，關(guān)于該復(fù)方中藥物炮制增效的機(jī)理還有待下一步研究。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）05-1059-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.040

2013-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81274085）

潘 新 （1988—） ， 女， 博士生， 主要從事中藥學(xué)研究。 Tel： 18607196428， E-mail： px520520@126.com

*通信作者： 胡昌江 （1952—） ， 男， 教授， 博士 生導(dǎo) 師， 主要 從事 中藥炮 制學(xué) 的教學(xué) 和科 研。 Tel： 13980980796 ， E-mail： hhccjj@ hotmail.com