近紅外光譜法高通量分析黃連上清丸的總體質量差異

陳 楊， 范 琦*， 王以武， 董艷虹， 吳阮琦， 李 娟

（1.重慶醫(yī)科大學藥學院， 重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學藥學實驗中心， 重慶 400016）

近紅外光譜法高通量分析黃連上清丸的總體質量差異

陳 楊1， 范 琦1*， 王以武2， 董艷虹1， 吳阮琦1， 李 娟1

（1.重慶醫(yī)科大學藥學院， 重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學藥學實驗中心， 重慶 400016）

目的 建立高通量快速無損近紅外光譜法分析黃連上清丸的總體質量差異。方法 取黃連上清丸濃縮水丸和普通水丸6個生產企業(yè)作為校正集和驗證集。測量它們近紅外漫反射光譜并采用主成分分析法計算得分進行判別分析，計算得分的協(xié)方差矩陣S進行廣義方差分析。結果 建立黃連上清丸制劑類型及廠家的判別分析模型，校正集和驗證集的正判率均為 100.0%； 廣義方差模型計算廣義方差值。 結論 近紅外光譜法結合判別分析能夠識別黃連上清丸的制劑類型及廠家；結合廣義方差分析能夠量化表征黃連上清丸的總體質量差異。

近紅外光譜法；化學計量學；總體質量差異；黃連上清丸

黃連上清丸是我國常用的一種中成藥，主要治療因風熱上攻、肺胃熱盛所致的頭暈目眩、暴發(fā)火眼、牙齒疼痛、口舌生瘡、咽喉腫痛、耳痛耳鳴、大便秘結和小便短赤。黃連上清丸由黃連、梔子等17味藥材制成丸劑， 依據黏合劑不同分為水丸、水蜜丸和大蜜丸；其中，水丸又依據提取濃縮與否分為濃縮水丸 （concentrated and watered pill） 和普通水丸 （ common watered pill）［1］。 黃連上清丸的生產廠家眾多，獲準的品種規(guī)格多達兩百余種。中藥制劑，尤其是多廠家的中藥復方制劑，常因藥材產地、輔料、生產工藝、生產狀態(tài)等不同使其總體質量差異較大，成為中藥制劑發(fā)展的一個主要制約因素。因此，有必要對黃連上清丸的總體質量差異進行分析及控制。

目前，中藥制劑總體質量差異的分析方法主要包括目視法、 核 磁共振指紋圖譜法［2］、氣相色譜指紋圖譜法［3］和高效液相色譜指紋圖 譜法［4-6］。 其中，目視法依據中藥制劑的大小、顏色、表面特征等外觀性狀進行分析。但是，中藥制劑的外觀性狀易于人為改變，且肉眼觀察比較主觀。核磁共振指紋圖譜法使用有毒試劑，污染環(huán)境。氣相色譜指紋圖譜法和高效液相色譜指紋圖譜法依據中藥制劑所含數種物質成分的化學性質進行分析，未考慮其他成分及物理性質對中藥制劑質量的影響，且因耗時、 破壞 樣 品 而 不 宜 用 于 過 程 分 析［7-8］和 現(xiàn) 場 分析。因此，需要建立一種高通量快速無損的分析方法，為控制黃連上清丸的總體質量差異、加強監(jiān)督管理、維護消費者及廠家的權益提供技術支持。

近紅外光譜幾乎可以獲得含氫基團的全部信息。 這些信息來源于被測物質分子 C-H、 N-H、 OH等含氫基團振動的倍頻與合頻吸收。近紅外光譜的信息豐富，譜帶復雜。表現(xiàn)為很多官能團的倍頻峰、合頻峰疊加在一起形成很多寬的吸收譜帶，且吸收系數低。因此，難以采用近紅外光譜中某（些） 吸收譜帶直接對樣品進行分析。近紅外光譜法 （near infrared spectroscopy， NIRS） 結合化學計量學技術 （ chemometric techniques），能夠在特征譜段甚至全光譜范圍內，找出被眾多共性所掩蓋的微弱特性，提取特征信息，建立充分反映光譜特征與待測特性之間關系的數學模型，實現(xiàn)復雜體系的高通量、 快速及無損分析［9-10］， 在中成藥分析中日益得到重 視［11-13］。 本 實驗 基 于 近紅 外 漫 反射 光 譜法 （ near infrared diffuse reflectance spectroscopy，NIRDRS）， 應用化學計量學技術， 分析黃連上清丸的制劑類型間、廠間和批間的總體質量差異。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 AntarisⅡ傅立 葉變換 近紅外 光譜儀（ 美國 Thermo Fisher Scientific） ， 配 備 銦 鎵 砷 檢 測器、 積分球附件和樣品旋轉杯， 控制軟件為 RESULT 3.0。

1.2 藥品 收集市售黃連上清丸樣品共31 批，見表1。

2 方法與結果

2.1 近紅外漫反射光譜測量

2.1.1 丸劑樣品的近紅外漫反射光譜測量 取同一批黃連上清丸樣品適量，置樣品旋轉杯中，使樣品填裝高度約為 1.8 cm。 設置光譜測量參數： 掃描范圍 9 999.1 ～3 799.1 cm-1， 分辨率 4 cm-1，掃描次數 64， 每次樣品測量前測量并扣除背景。每個樣品重復填裝并測量 5 次［14］， 所得 155 張丸劑樣品的近紅外漫反射光譜見圖1 （1-1）。

表1 黃連上清丸樣品Tab.1 Sam p les of Huanglian Shangqing Pills

另使樣品填裝高度約為 1.1 cm， 用以上方法及參數測量各批丸劑樣品的原始近紅外漫反射光譜， 見圖 1 （1-2）。

2.1.2 丸粉樣品的近紅外漫反射光譜測量 分別粉碎各批黃連上清丸樣品，并使各批丸粉樣品的粒度相近。 設置光譜測量參數： 掃描范圍 10 001.0 ～3 799.1 cm-1，分辨率8 cm-1， 掃描次數 64， 每次樣品測量前測量并扣除背景。 按 “2.1.1” 項方法測量得到 155 張丸粉樣品的原始近紅外漫反射光譜見圖1 （2）。

圖1 黃連上清丸樣品的原始近紅外漫反射光譜圖Fig.1 Raw near in frared diffuse reflectance spectra for Huanglian Shangqing Pills

2.2 制劑類型間總體質量差異分析

2.2.1 判別分析 從濃縮水丸及普通水丸樣品中各取14 批和10 批作為校正集， 其余為驗證集。判別分析 （ discriminant analysis） 使用的建模軟件為AntarisⅡ傅立葉變換近紅外光譜儀配置的 TQ Analyst8.0 （美國 Thermo Fisher Scientific）， 軟件自動選取的建模光譜范圍為 9 875.7 ～3 922.5 cm-1，見圖2 （1） 和 （2）。

圖2 黃連上清丸濃縮水丸和普通水丸建模近紅外光譜Fig.2 Near infrared diffuse reflectance spectra used in modeling for Huanglian Shangqing Pills of concentrated and watered pills and common watered pills

采用主成分分析法 （ principal component analysis） 對濃縮水丸及普通水丸樣品的近紅外光譜數據降維［15］， 部分建模光譜的前兩個主成分的得分見表2。

表2 濃縮水丸和普通水丸部分建模光譜的前2個主成分的得分Tab.2 First two principal com ponent scores of partial modeling spectra for concentrated and watered pills and common watered pills

取前 2 個主成分 （ principal component） （第一主成分和第二主成分的貢獻率分 別為 98.7% 和1.1%， 累積貢獻率為99.8%） 的得分建立黃連上清丸制劑類型的判別分析模型，校正集和驗證集的正判率均為 100.0%。 留一法交叉驗證 （ leave-one-out cross-validation） 的正判率為 100.0%， 表明模型的穩(wěn)定性良好。采用改變丸劑樣品填裝高度至約為1.1 cm時測得的近紅外漫反射光譜數據進行分析， 正判率為 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 圖 3 （1）顯示濃縮水丸及普通水丸的校正樣品各自聚集，表明黃連上清丸不同制劑類型間的總體質量存在顯著差異。圖中符號△和○表示相應的制劑類型。

采用丸粉樣品的近紅外光譜建立判別分析模型時， 建模光譜范圍為 9 877.6 ～3 922.5 cm-1， 該光譜區(qū)域內濃縮水丸和普通水丸的近紅外光譜見圖2（3） 和 （4）。 前 2 個主成分 （貢獻率分別為 96.6%和 3.1%， 累積貢獻率為 99.7%） 的得分見表 2， 校正集、驗證集和留一法交叉驗證的正判率均為100.0%。 圖 3 （2）顯示校正樣品的分析結果。

圖3 黃連上清丸制劑類型判別分析的校正集結果圖Fig.3 Plots for the discrim inant analysis models for the preparations of Huanglian Shangqing Pills in the calibration sets

上述結果表明，近紅外光譜判別分析能夠準確、直觀地識別黃連上清丸的不同制劑類型；而近紅外光譜廣義方差分析能夠量化表征黃連上清丸不同制劑類型間的差異大小。以上兩個分析方法一起使用，能夠同時定性、定量地表征黃連上清丸制劑類型間的總體質量差異。對于質量控制，宜使用未經處理的丸劑樣品；但對于監(jiān)督管理，使用丸粉樣品能有效降低樣品大小形態(tài)對分析的干擾。

2.3 廠間總體質量差異分析

2.3.1 判別分析

2.3.1.1 濃縮水丸 從廠 A和廠 B的樣品中各取7批作為校正集，其余為驗證集。軟件自動選取的建模光譜范圍為 9 875.7 ～3 922.5 cm-1， 見圖 4（1） 和 （2）。

圖4 黃連上清丸各廠樣品建模近紅外光譜Fig.4 Near infrared d iffuse reflectance spectra used in modeling for Huanglian Shangqing Pills from differentmanufacturers

采用主成分分析對廠A和廠B樣品的近紅外光譜數據降維。前6個主成分的貢獻率分別為85.3%、 11.3%、3.1%、 0.1%、0.1%和 0.1%，累積貢獻率為 100.0%， 相應的得分見表 3。

以前6個主成分的得分建立濃縮水丸的廠家判別分析模型，校正集和驗證集的正判率均為100.0%。 留一法交叉驗證的正判率為 100.0%，表明模型的穩(wěn)定性良好。采用改變丸劑樣品填裝高度至約為 1.1 cm時測得的近紅外漫反射光譜數據進行分析， 正判率為 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 圖 5 （1）顯示廠 A和廠 B的校正樣品各自聚集，表明不同廠家濃縮水丸的總體質量存在顯著差異。圖中大寫字母A和B表示相應的廠家。

圖5 黃連上清丸廠家判別分析的校正集結果圖Fig.5 Plots for the discrim inant analysismodels for the manufacturers of Huanglian Shangqing Pills in the calibration sets

表3 濃縮水丸部分建模光譜的前6個主成分得分Tab.3 First six principal components scores of partialmodeling spectra for concentrated and watered pills

2.3.1.2 普通水丸 從廠 C和廠 D的樣品中各取3批作為校正集，廠E和廠F的各2批樣品均作為校正集 （以實施留一法交叉驗證）， 其余為驗證集。 軟件自動選取的建模光譜范圍為 9 875.7 ～ 3 922.5 cm-1，見圖 4 （3） ～ （6）。 采用主成分分析對普通水丸樣品的近紅外光譜數據降維。5個主成分的貢獻率分別為 74.2%、 23.3%、 1.7%、0.6%和0.2%， 累積貢獻率為 100.0%， 相應的得分見表4。

表4 普通水丸部分建模光譜的前5個主成分得分Tab.4 First five p rincipal com ponents scores of par tial modeling spectra for common watered pills

以前5個主成分的得分建立普通水丸的廠家判別分析模型，校正集和驗證集的正判率均為100.0%。 留一法交叉驗證的正判率為 100.0%，表明模型的穩(wěn)定性良好。采用改變丸劑樣品填裝高度至約為 1.1 cm時測得的近紅外漫反射光譜數據進行分析， 正判率為 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 圖 5 （2） 顯示廠 C、 D、 E和 F的校正樣品各自聚集，表明不同廠家普通水丸的總體質量存在顯著差異。 圖中大寫字母 C、D、E和 F表示相應的廠家。

2.3.2 廣義方差分析

上述結果表明，近紅外光譜判別分析能夠準確、直觀地識別黃連上清丸的不同廠家；而近紅外光譜廣義方差分析能夠量化表征黃連上清丸不同廠家間的差異大小。以上兩個分析方法一起使用，能夠同時定性、定量地表征黃連上清丸各廠家間的總體質量差異。與丸劑的制劑類型間總體質量差異分析相比，廠家判別分析模型使用的主成分數較多、廣義方差值較小，均表明廠間總體質量差異較制劑類型間的小。

2.4 批間總體質量差異分析

2.4.1 主成分分析

2.4.1.1 濃縮水丸 分別計算黃連上清丸廠 A和廠 B共19批各批樣品的平均近紅外光譜。 軟件自動選取的建模光譜范圍為 9 875.7 ～3 922.5 cm-1。采用主成分分析對各批樣品的平均近紅外光譜數據降維， 前 3 個主成分 （ 貢獻率分別為 85.1%、11.5%和 3.1%， 累積貢獻率為 99.7%） 的得分在三維空間的分布見圖 6 （1）。圖 6 （1）顯示， 廠A各批樣品的平均近紅外光譜數據的主成分得分明顯比廠B的集中，說明廠A的批間總體質量差異比廠B的小。

圖6 黃連上清丸各批樣品平均近紅外光譜數據前 3個主成分的得分在三維空間的分布Fig.6 Three-d imensional distributions of the first three principal components scores of themean NIR spectra for each batch of Huanglian Shangqing Pills

2.4.1.2 普通水丸 分別計算黃連上清丸廠 C、D、 E和F共12 批各批樣品的平均近紅外光譜。 前3 個 主 成 分 （貢 獻 率 分 別 為 74.0%、23.5% 和1.7%， 累積貢獻率 99.2%）的得分在三維空間的分布見圖 6 （2）。 圖 6 （2） 說明廠 C的批間總體質量差異比廠D、 E和F的小。

2.4.2 廣義方差分析

上述結果表明，近紅外光譜主成分分析能夠直觀表征黃連上清丸的批間總體質量差異；而近紅外光譜廣義方差分析能夠量化表征黃連上清丸的批間差異大小，可用于廠內偏差警戒限及糾偏限的設定。以上兩個分析方法一起使用，能夠同時定性、定量地表征黃連上清丸批間的總體質量差異。此外，雖然廠E和廠F各自只有2批樣品，不能參與普通水丸廣義方差值的計算，但其批間總體質量差異仍然能夠用主成分分析進行識別。比較廣義方差值可知，黃連上清丸批間總體質量差異較其廠間及制劑類型間的小。

綜上所述，黃連上清丸總體質量差異按制劑類型間、廠間和批間的順序遞減。所建近紅外光譜法能夠高通量無損分析黃連上清丸的總體質量差異。其中，制劑類型間及廠間的總體質量差異分析策略可用于監(jiān)督管理與質量控制；批間的總體質量差異分析策略可用于廠內偏差警戒限及糾偏限的設定及過程控制［18］。

3 討論

3.1 光譜測量參數 分辨率和掃描次數均是近紅外光譜測量的重要參數。分別針對丸劑和丸粉樣品， 考察 了 分 辨率 2 cm-1、 4 cm-1、8 cm-1和16 cm-1， 掃描次數 32、 64 和 128。 結果， 丸劑樣品以分辨率 4 cm-1和掃描次數 64 為宜； 丸粉樣品以分辨率 8 cm-1和掃描次數 64 為宜。

3.2 光譜處理方法 比較了未處理、 一階導數、二階導數、Savitzky-Golay平滑和 Norris平滑處理的光譜數據所建判別分析模型的性能。結果顯示，未處理光譜數據所建判別分析模型的性能較好，且計算簡單。故本實驗采用原始光譜數據進行分析。

致謝：感謝重慶市科委應用技術研發(fā)項目（cstc2012gg-yyjs10039） 和重慶市渝中區(qū)科委科技計劃項目 （20120206） 的資助；感謝賽默飛世爾科技有限公司的支持。

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H igh-throughput analysis of population quality of Huanglian Shangqing Pills by near infrared spectroscopy

CHEN Yang1， FAN Qi1*， WANG Yi-wu2， DONG Yan-hong1， WU Ruan-qi1， LI Juan1
（1.Schoolof Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China； 2.Pharmaceutical Experiment Centre， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

AIM To establish high-throughput， rapid and non-destructive approaches of near infrared spectro scopy to analyse the population quality variances of Huanglian Shangqing Pills.METHODS Concentrated and watered pills and common watered pills of Huanglian Shangqing Pills were obtained from six manufacturers and served as calibration set and validation set， respectively.Near infrared diffuse reflectance spectra combined with principle component analysis were used for discriminant analysis and the calculation of covariancematrix S for generalized variance analysis.RESULTS The accuracy of predictingmodel，calibration set and validation set were approximately to 100%.CONCLUSION Near infrared spectroscopy plus discriminantanalysis could distinguish themanufacturers and their preparations， and plus generalized variance would present the population quality of Huanglian Shangqing Pills.

near infrared spectroscopy； chemometrics； whole quality variance； Huanglian Shangqing Pills

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0973-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.020

2013-06-25

重慶市科委應用技術研發(fā)項目 （ cstc2012gg-yyjs10039） ； 重慶市渝中區(qū)科委科技計劃項目 （20120206）

陳 楊 （1987—） ， 男， 碩士生， 從事藥物分析研究。 Tel： 13452825101， E-mail： chenyang86109@gmail.com

*通信作者： 范 琦 （1961—） ， 女， 博士， 教授， 從事藥物分析研究。 Tel： （023） 68485161， E-mail： fanqi787@gmail.com