LC-MS/MS法測(cè)定復(fù)方祖師麻提取物中 8 種成分溶出影響

陳良慧， 單進(jìn)軍， 謝 彤， 狄留慶*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023； 2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心， 江蘇 南京 210023； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 江蘇 南京 210023）

［質(zhì) 量］

LC-MS/MS法測(cè)定復(fù)方祖師麻提取物中 8 種成分溶出影響

陳良慧1，2， 單進(jìn)軍2，3， 謝 彤3， 狄留慶1，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023； 2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心， 江蘇 南京 210023； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 江蘇 南京 210023）

目的 建立一種 LC-MS/MS 的分析方法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方祖師麻提取物 （祖師麻與甘草質(zhì)量比 3 ∶2） 中 8 種成分（瑞香素、 西瑞香素、 7-OH香豆素、 甘草酸、 甘草苷、 異甘草苷、 甘草素和異甘草素）， 并應(yīng)用此方法考察兩者配伍前后活性成分提取率的變化情況。 方法 Hypersil Gold-C18色譜柱 （50 mm×2.1 mm， 1.9 μm） ， 乙腈-0.05%甲酸水梯度洗脫， 體積流量為 0.3 mL/min， 柱溫為 35 ℃。 質(zhì)譜條件為采用負(fù)離子模式， 以 SRM方式進(jìn)行定量。 結(jié)果 甘草配伍祖師麻后， 祖師麻中 3 種活性成分 （瑞香素、 西瑞香素和 7-OH香豆素） 的量均有一定程度的增加， 其中尤以瑞香素的增加最為顯著； 祖師麻降低甘草中苷類成分 （甘草酸、 甘草苷和異甘草苷） 溶出， 而對(duì)苷元 （甘草素和異甘草素）的溶出稍有提高。結(jié)論 該分析方法能快速、特異、靈敏并可重復(fù)檢測(cè)祖師麻和甘草中的主要活性成分，兩者配伍對(duì)8種成分提取率的影響并不相同。

祖師麻； 甘草； 配伍； 溶出度； LC-MS/MS

祖師麻為瑞香科瑞香屬植物黃瑞香 Daphne giraldii Nitsche.、 陜 甘 瑞香 Daphne tangutica Maxim.或凹葉瑞香 Daphne retusa Hemsl.的莖皮和根皮，收載于 《中國藥典》 1977 年版［1］。 其主要分布在四川、甘肅、陜西等地，為西部民間常用中藥，具有鎮(zhèn)痛、活血、消腫、祛風(fēng)除濕之功效，俗稱“打得地上爬，離不開祖師麻”，臨床上常用于治療風(fēng)濕痹痛、 關(guān)節(jié)炎、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)痛等［2-4］， 目前已上市制劑有祖師麻片、祖師麻膏藥、祖師麻注射劑、 祖師麻止痛噴霧劑 等［5-8］。 研究表明 祖師麻主要活性成分類型為香豆素和二萜類，但二萜類成分具有一定的刺激性，也是祖師麻中的毒性成分［9-12］。 甘草 為 豆 科 植 物 甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、 光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.或脹果甘草Glycyrrhiza inflate Batal.的根及根莖［13］， 其藥理作用廣泛， 具有 “協(xié)和諸藥， 使之不爭” 和 “解百藥毒” 之功效， 素有 “國老”、 “藥中之王” 等美譽(yù)［14-15］。 民間 用 藥經(jīng) 驗(yàn) 顯 示， 祖 師 麻與 甘 草 配 伍后具有一定的增效減毒作用，但其作用機(jī)理尚不清楚［16］。

復(fù)方祖師麻由祖師麻與甘草以質(zhì)量比3∶2比例配伍組成，本課題組研究發(fā)現(xiàn)在該比例下復(fù)方祖師麻提取物的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎效果較好。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定祖師麻 （香豆素） 和甘草 （黃酮和皂苷） 中的 8 種成分的 LC-MS/MS 分析方法， 并分別考察了甘草對(duì)祖師麻中活性成分及祖師麻對(duì)甘草中活性成分提取率的影響。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與藥品 祖師麻購自甘肅省隴南市禮縣藥材公司；甘草購自安徽省萬生中藥飲片有限公司。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金博士鑒定祖師麻為 瑞 香 科 植 物 黃 瑞 香 Daphne giraldii Nitsche.的干 燥莖皮； 甘草為 豆科植 物光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的 根莖。 瑞 香素 （ daphnetin，121025），西 瑞 香 素 （ daphnoretin， 130305 ）， 7-OH香豆素 （7-hydroxycoumarin， 120927），甘草酸（glycyrrhizin， 111023）， 甘草苷 （ liquiritin， 111127），異甘草苷 （ isoliquiritin， 201010） ， 甘草素 （ liquiritigenin， 201004 ） 和 異 甘 草 素 （isoliquiritigenin，101026）均購自四川省維克奇生物技術(shù)有限公司，以上對(duì)照品經(jīng) HPLC檢測(cè)， 純度均≥98%。 甲醇、乙腈 （ 色 譜 純， Merk， 德 國）； 甲 酸 （ 色 譜 純，ROE，美國）； 水為超純水， 其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 TSQ Vantage型串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國 Thermo Fisher公司） ， UltiMate 3000 型超高效液相色譜 （美國 Thermo Fisher公司）， CPA225D型電子 天 平 （德 國 Sartorius公 司 ），Allegra 64R centrifuge型離心機(jī) （ 美國 Beckman Coulter公司），KQ-500B型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）， Millipore Synergy型超純水系統(tǒng) （德國 Merck 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil Gold-C18色譜柱 （50mm× 2.1 mm， 1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸水溶液梯度洗脫， 0 ～1 min （10%乙腈）， 1 ～5 min（10% ～90%乙腈）， 5 ～6 min （90% ～100% 乙腈）， 6 ～8 min （100%乙腈） ， 8 ～9 min （100% ～10%乙腈）， 9 ～10 min （10%乙腈）；體積流量0.3 mL/min； 柱溫 35 ℃； 進(jìn)樣量 3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源， 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）， 負(fù)離子模式掃描， 氣化管溫度 450 ℃，鞘氣壓力 45 Arb， 輔氣壓力 25 Arb， 毛細(xì)管溫度350 ℃， 碰 撞 壓 力 1.5 mTorr， 噴 霧 電 壓 負(fù) 離 子3 000 eV； 各化合物的具體參數(shù)見表 1， 各對(duì)照品的提取離子流圖見圖1。

表1 質(zhì)譜條件Tab.1 MS conditions

2.3 藥液的制備 分別稱取祖師麻、 甘草、 祖師麻-甘草藥材各 3 份， 加 10 倍量的水，浸泡 0.5 h后， 煎煮2 h， 再加5 倍量水煎煮1 h，合并兩次濾液， 濃縮定容至 1 000 mL，分別獲得生藥量為162 mg/mL的祖師麻水提液、 108 mg/mL的甘草水提液、 270 mg/mL的祖師麻-甘草水提液。

2.4 供試品溶液的制備 精密吸取上述各藥液2 mL， 加水定容至 100 mL量瓶中， 搖勻。 再精密吸取稀釋后的各藥液5 m L， 加入5 mL甲醇， 渦旋3 min， 16 000 r/min 離心 10 min 吸取 10 μL上清液， 再加入 90 μL的 初始流動(dòng)相， 渦旋 1 min，16 000 r/min離心 10 min， 3 μL進(jìn)樣。

圖1 各成分的提取離子流圖譜Fig.1 Extracted ion chromatogram s of the anlaytes

2.5 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取瑞香素、西瑞香素、 7-OH香豆素、 甘草苷、 甘草素、 異甘草苷、 異甘草素和甘草酸的對(duì)照品5 mg， 加500 μL的 DMSO， 超聲溶解后， 再加甲醇稀釋并定容至5 mL量瓶中，得到質(zhì)量濃度為 1 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 采用倍半稀釋法配制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品系列溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行 3 份。 吸取 10 μL對(duì)照品系列溶液， 再加 90 μL流動(dòng)相稀釋混勻， 16 000 r/min 離心 10 min 后取上清液進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為 3 μL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（ng/mL） 為橫坐標(biāo) （X）， 對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 作圖， 經(jīng)回歸分析， 線性關(guān)系結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系結(jié)果Tab.2 Result of linearity correlation

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL， 再加 90 μL流動(dòng)相稀釋混勻， 16 000 r/min離心 10 min 后取上清進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為 3 μL，重復(fù)進(jìn)樣 6 次。 測(cè)得的瑞香素、 西瑞香素、 7-OH香豆素、甘草酸、甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素的 RSD分別為 2.0%、 2.6%、 2.0%、2.4%、1.8%、 2.3%、 1.5% 和 1.4%， 均 小 于 3.0%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所使用的儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，室溫條件下放置， 按照樣品測(cè)定方法于 0、 2、 4、8、12 h 后進(jìn)樣， 計(jì)算得到瑞香素、西瑞香素、7-OH香豆素、甘草酸、甘草苷、異甘草苷、甘草素和 異 甘 草 素 的 RSD分 別 為 2.3%、 3.0%、2.8%、 2.6%、 1.8%、 2.6%、 3.8% 和 3.2%，均小于 4.0%； 說明供試品溶液在室溫下 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取 6 份祖師麻-甘草水提液， 按 “2.4” 項(xiàng)中的供試品溶液的制備方法，平行處理， 并按 “2.1” 項(xiàng)和 “2.2” 項(xiàng)中的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算瑞香素、西瑞香素、7-OH香豆素、 甘草酸、 甘草苷、 異甘草苷、 甘草素 和 異 甘 草 素 的 RSD 分 別 為 2.6%、 4.0%、2.7%、 4.6%、 2.7%、 4.1%、 2.0% 和 3.9%，均小于5.0%； 結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取1mL已知質(zhì)量濃度的祖師麻-甘草水提液 6 份， 分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液， 按 “2.4” 項(xiàng)中的供試品溶液的制備方法，平行處理； 并按 “2.1”項(xiàng)和 “2.2”項(xiàng)中的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表 3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 （n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

2.7 樣品測(cè)定 按 “2.3” 項(xiàng)步驟制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算配伍前后水提液中各成分的量，結(jié)果見表4。

表 4 配伍前后活性成分的測(cè)定結(jié)果 （μg·m L-1， n=3）Tab.4 Concentrations of analytes after com patibility（μg·m L-1， n=3）

結(jié)果顯示，祖師麻中3種香豆素類成分含有量的順序是： 瑞香素 ＞西瑞香素 ＞7-OH香豆素。 與祖師麻水提液相比， 祖師麻-甘草水提液中 3 種香豆素類成分均有一定程度的增加， 除 7-OH香豆素的量沒有明顯增加外，其余2種成分分別增加了8.2%和15.3%， 其中西瑞香素的含有量變化有顯著性差異 （P＜0.05）； 而瑞香素的含有量變化有極顯著性差異 （P＜0.01）。

甘草中各成分含有量的順序?yàn)椋焊什菟幔靖什蒈眨井惛什蒈?＞甘草素 ＞異甘草素。 與甘草水提液相比， 祖師麻-甘草水提液中甘草酸、 甘草苷和異甘草苷均降低， 分別降低了 15.7%、 10.4%和14.4%， 且都存在極顯著性差異 （P＜0.01）； 而甘草素和異甘草素分別增加了 19.3%和 3.1%，其中甘草素的含有量變化有極顯著性差異 （P＜0.01）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，經(jīng)過考察與驗(yàn)證，該方法能快速、特異、靈敏并可同時(shí)檢測(cè)祖師麻和甘草中的8種主要活性成分，并成功應(yīng)用于兩者配伍前后活性成分提取率變化的考察，為探索其配伍機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)比較了祖師麻與甘草配伍前后主要活性成分含有量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)祖師麻與甘草配伍后， 祖師麻中的3種香豆素類成分 （瑞香素、 西瑞香素和 7-OH香豆素） 的量均增加， 其中瑞香素的量增加最為顯著；而甘草中的3種苷類成分（甘草酸、 甘草苷和異甘草苷） 均降低， 2種苷元（甘草素和異甘草素） 的量卻有所增加。 這一結(jié)果說明甘草能提高祖師麻中主要活性成分的提取率；而祖師麻中的某些成分促進(jìn)了甘草中苷類成分的水解。已有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草對(duì)葛根素和黃芩苷有增溶作用，并推測(cè)甘草中起增溶作用的是其皂苷類成分甘草酸［17］。 上述現(xiàn)象說明中藥配伍并非成分間的簡單疊加，而是通過相互影響，重新組合成一個(gè)整體，再發(fā)揮藥效。本實(shí)驗(yàn)考察了配伍對(duì)各個(gè)成分提取率的影響，但其配伍機(jī)制還需進(jìn)一步的探討研究。

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Influence of Zushima combined with Gancao on dissolution of their eight components by LC-MS/MS

CHEN Liang-hui1，2， SHAN Jin-jun2，3， XIE Tong3， DILiu-qing1，2*
（1.Collegeof Pharmacy， Nanjing University of ChineseMedicine， Nanjing 210023， China； 2.Jiangsu Provincial Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM， Nanjing 210023， China； 3.The First Medicine College， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

AIM To use LC-MS/MSmethod to simultaneously analyse eight active components（ daphnetin，daphnoretin， 7-hydroxycoumarin， glycyrrhizin，liquiritin， isoliquiritin，liquiritigenin and isoliquiritigenin）extracted from combination of Zushima（Daphne giraldii Nitsche.） and Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma） （ ratio of 3 ∶2） and their mutual solubility.METHODS The analytes were seperated by Hypersil Gold-C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm） at35 ℃ and acetonitrile-0.05%formic acid used as themobile phase with gradientelution on the rate of 0.3 mL/min.A negative ionization selective reaction monitoringmodel and electrospray ionization source was applied to the analysismethod.RESULTS The separption efficient peaks presented a good linearity.After Zushima combined with Gancao， the concentrationsof three components in Zushima（ daphnetin， daphnoretin and 7-hydroxycoumarin） increased to some extent， especially for daphnetin.The concentrations of glycosides（ glycyrrhizin， liquiritin and isoliquiritin）in Gancao decreased while thatof aglycones（ liquiritigenin and isoliquiritigenin） increased.CONCLUSION Themethod is rapid， simple and accurate， which can be used to simultaneously detect the concentrations of the main components in Zushima and Gancao， and the influence of compatibility on their extraction rates is not the same.

Zushima（ Daphne giraldii Nitsche）；Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma ） ；combination；dissolution； LC-MS/MS

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0965-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.018

2013-10-12

國家自然科學(xué)基金 （81273655）； 江蘇省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目 （JHB2012-19）

陳良慧 （1988—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥生物藥劑學(xué)。 Tel： 15952022917， E-mail： chenlhnow@126.com

*通信作者： 狄留慶， 教授， 博士， 研究方向： 中藥制劑新型給藥系統(tǒng)。 Tel： （025） 85811071， E-mail： diliuqing928@163.com