UPLC-MS法同時測定大鼠血漿中氧化芍藥苷、 沒食子酸及咖啡酰基奎寧酸類成分

鄭 林， 唐 麗， 牟景麗， 黃 勇， 董 莉， 蘭燕宇*

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004）

［制 劑］

UPLC-MS法同時測定大鼠血漿中氧化芍藥苷、 沒食子酸及咖啡?；鼘幩犷惓煞?/p>

鄭 林1，2， 唐 麗1， 牟景麗1， 黃 勇1，2， 董 莉1，2， 蘭燕宇1，2*

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004）

目的 建立 UPLC-MS 法同時測定大鼠靜脈注射辛芍 （燈盞細辛和赤芍） 提取物后血漿中氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩?、 3，4-二咖啡酰基奎寧酸、 4，5-二咖啡?；鼘幩?5 種成分的分析方法。 方法 血漿樣品酸化后經(jīng)乙腈沉淀除去蛋白， UPLC分析采用 Waters Acquity BEH C18色譜柱， 流動相為 0.1%甲酸乙腈 -0.1%甲酸水梯度洗脫，采用電噴霧電離源，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測模式。結(jié)果 5種成分在血漿中線性關(guān)系良好，提取回收率 91.95% ～109.09%， 日內(nèi)、 日間精密度和準確度良好， 被測成分在大鼠體內(nèi)消除較快。 結(jié)論 本分析方法特異、快速、 準確靈敏， 可用于氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩?、 3，4-二咖啡酰基奎寧酸、 4，5-二咖啡酰基奎寧酸的藥代動力學(xué)研究。

UPLC-MS； 藥動學(xué)研究； 辛芍提取物； 大鼠

在貴州少數(shù)民族地區(qū)常用燈盞細辛和赤芍組方（簡稱 “辛芍組方”） 用于治療中風(fēng)、 偏癱， 具有較好的臨床療 效［1-2］。 本方以燈 盞細辛 為君， 化瘀通絡(luò)，赤芍涼血熱、通經(jīng)絡(luò)，治血熱瘀滯，助君藥以達活血化瘀、散瘀通絡(luò)之效。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)該組方能迅速改善腦缺血動物的癥狀，對腦缺血性大鼠及小鼠有明顯保護作用；增加大鼠腦血流， 改善 缺 血 大 鼠 腦 微 循 環(huán)［3-6］。 為 了 “ 辛 芍 組方”的深層次開發(fā)利用，本實驗在參考有關(guān)文獻基礎(chǔ)上［7-8］， 以氧 化 芍 藥苷、 沒 食 子 酸、 1，3-二 咖啡?；鼘幩?、 3、4-二咖啡酰基奎寧酸、 4，5-二咖啡?；鼘幩釣闄z測指標， 采用 UPLC-MS 法研究大鼠靜脈注射辛芍提取物后所測成分的藥代動力學(xué)特征， 并應(yīng)用 DAS 2.0 軟件計算各物質(zhì)的藥動學(xué)參數(shù)，進而分析辛芍提取物在大鼠體內(nèi)的體內(nèi)過程，為辛芍組方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Acquity系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 （ 美國 Waters公司， 包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和 Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站）； Allegra 64R高速離心機 （美國 Beckman Coulter公司） ； ZH-2 渦旋混合器 （天津藥典標準儀器廠）； MTN-2800D氮吹儀（天津奧特塞恩斯公司）； AE240 分析天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）； CQ 250A-TS 超聲波清洗機 （上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試 劑 與 試 藥 沒 食 子 酸 （ 批 號 110831-200803）、1，3-O-二咖 啡 酰 奎 寧 酸 （ 批號 111717-200501）、 葛 根素 （ 內(nèi) 標， 批 號 110752-200912 ）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷（批號 20120310）、3，4-O-二咖啡?？鼘幩?（批號Y59-20130115 ）、4， 5-O-二 咖 啡 酰 奎 寧 酸 （批 號1384-101215） 對照品購自中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心； 辛芍提取物自制 （批號20120615）； 色譜乙腈 （德國 Merck 公司）；水為超純水；其余溶劑均為分析純。1.3 實驗動物 健康 SD大鼠 6 只， 雌雄兼用，體質(zhì)量為 （230 ±10） g， 由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供， 動物許可證號 SCXK （黔） 2002-0001。

2 實驗方法

2.1 標準溶液的配制 精密稱取氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩?、 3，4-二咖啡?；鼘幩帷?4，5-二咖啡?；鼘幩徇m量，用甲醇溶解定容至 10 mL。 獲得氧化芍藥苷 （0.97 mg/mL）、沒食子酸 （0.56 mg/mL）、 1，3-二咖啡酰基奎寧酸（0.482 mg/m L）、 3，4-二咖啡?；鼘幩?（0.595 mg/mL）、 4， 5-二 咖 啡 酰 基 奎 寧 酸 （ 0.470 6 mg/mL） 的貯備液。 取葛根素貯備液適量， 置 25 m L量瓶中加甲醇稀釋至刻度，獲得葛根素工作溶液 （20 μg/mL）， 置冰箱 （ -20 ℃） 保存， 備用。

2.2 色 譜 條 件 Waters Acquity BEH C18色 譜 柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）； 流動相為 0.1%甲酸乙腈 （ A） -0.1%甲酸水 （B）， 梯度洗脫 （0 ～3 min， 5% ～25%A； 3 ～4 min， 25% ～90%A；4 ～5 min， 90% ～5%A）； 體 積 流 量 為 0.35 mL/min；柱溫 45 ℃， 進樣器的溫度 15 ℃， 進樣體積為1 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源 （ESI）， 毛細管電離電壓 3 kV，離子源溫度 120 ℃； 噴霧氣與反吹氣為 N2， 去溶劑氣體積流量 650 L/h， 去溶劑氣溫度350 ℃， 反吹氣體積流量為50 L/h； 掃描方式為選擇性離子監(jiān)測模式 （SIR）， 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為 MassLynx V4.1 工作站。 氧化芍藥苷等5種成分及內(nèi)標用于定量分析的監(jiān)測離子質(zhì)譜信息見表1。

表1 5種成分的質(zhì)譜條件Tab.1 Five com ponen tsm ass spectrometric conditions

2.4 血漿樣品處理方法 取大鼠血漿 100 μL，依次加 入 10 μL內(nèi) 標 葛 根 素 溶 液 （20 μg/mL），50 μL 1%甲 酸 溶液， 400 μL乙腈， 渦 混 1 min，15 000 r/min， 離心 10 min， 取上清液置離心管中，45 ℃氮氣吹干，殘留物用 300 μL甲醇溶解， 離心， 取上清1μL進樣。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 取大鼠空白血漿 100 μL， 除不加內(nèi)標外， 其余按 “2.4” 項下操作， 得空白樣品色譜圖A；將一定濃度的混合標液和內(nèi)標溶液加入空白血漿，依法操作，得相應(yīng)色譜圖 B；取大鼠給藥后血漿， 依法操作， 得相應(yīng)色譜圖 C， 見圖 1。 由結(jié)果可以看出氧化芍藥苷等5種成分分離良好，基質(zhì)無干擾。

圖 1 SIR色譜圖Fig.1 SIR chromatograms

3.2 線性范圍和靈敏度 取大鼠空白血漿100 μL，依次加入系列混合標準溶液 50 μL， 按 “血漿樣品處理方法”項下操作，建立標準曲線。以待測物的峰面積與內(nèi)標峰面積之比 （ A/Ai） 為縱坐標 Y，各物質(zhì)質(zhì)量濃度 （C） 為橫坐標 X進行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為 1/X， 求出直線方程， 即為標準曲線。 5個成分的線性方程分別為：氧化芍藥苷 Y= 1.004 8X+0.040 3 （ 線 性 范 圍 0.048 ～11.55 μg/mL， r＞0.996）、沒食子酸 Y=1.565X+0.099（0.067 ～16.19 μg/mL， r＞0.999 4）、 1，3-二咖啡?；?寧 酸 Y=0.823X+0.010 2 （0.024 ～5.738 μg/mL， r＞0.999）、3，4-二咖啡?；?奎寧酸 Y= 1.169X+0.001 5 （0.029 ～7.083 μg/mL， r=1）、4，5-二 咖 啡 酰 基 奎 寧 酸 Y=0.920 7X+0.001 7（0.023 ～5.602 μg/mL， r＞0.999 8）。

3.3 準確度和精密度 按 “3.2 標準曲線” 項下分別配制 5個成分大鼠血漿質(zhì)量控制樣品（QC）， 每一個質(zhì)量濃度進行 5 樣本分析， 連續(xù)測定3 d。 氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩?、 3，4-二咖啡?；鼘幩帷?4，5-二咖啡酰基奎寧酸5個成分準確度、日內(nèi)、日間精密度均良好，結(jié)果見表2。

表2 大鼠血漿中5種成分的日內(nèi)、 日間精密度和準確度（， n=6， 3 days）Tab.2 Accuracy， intra-and inter-day precision of the five components（， n=6， 3 days）

表2 大鼠血漿中5種成分的日內(nèi)、 日間精密度和準確度（， n=6， 3 days）Tab.2 Accuracy， intra-and inter-day precision of the five components（， n=6， 3 days）

檢測成分加入質(zhì)量濃度/（ μg·m L-1）血漿質(zhì)量濃度/（ μg·mL-1）日內(nèi)精密度RSD/%日間精密度RSD/%準確度/%沒食子酸氧化芍藥苷1，3-二咖啡酰基奎寧酸3，4-二咖啡?；鼘幩?，5-二咖啡?；鼘幩?.20 0.21 ±0.01 3.37 6.76 105.00 1.80 1.74 ±0.01 0.87 2.26 97.00 16.20 15.66 ±0.17 1.12 0.67 96.65 0.14 0.14 ±0.01 6.06 3.90 98.57 1.28 1.28 ±0.02 1.56 1.77 100.00 11.55 11.21 ±0.42 3.82 2.52 97.09 0.07 0.07 ±0.01 1.84 6.65 100.00 0.64 0.64 ±0.02 2.39 3.24 99.06 5.74 5.51 ±0.09 1.61 1.25 96.06 0.09 0.09 ±0.01 0.99 1.15 100.00 0.79 0.76 ±0.02 2.08 0.80 96.20 7.08 6.92 ±0.08 0.98 3.59 97.68 0.07 0.07 ±0.01 6.21 5.04 102.86 0.62 0.64 ±0.03 4.82 6.63 103.23 5.60 5.34 ±0.16 2.93 3.63 95.29

3.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察 配制 5 個成分的大鼠血漿低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品（QC）， 按 “2.4 血漿樣品處理” 項下操作， 獲得相應(yīng)峰面積值 （A）； 另取空白血漿， 按 “血漿樣品處理”項下操作，離心后獲得上清液，加入與上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的標準溶液， 于 30 ℃氮氣吹干， 以 300 μL甲醇復(fù)溶， 獲得相應(yīng)峰面積值 （B）； 另取上述低、中、 高3 個質(zhì)量濃度的對照溶液 50 μL與內(nèi)標10 μL， 30 ℃氮氣吹干， 殘留物以300 μL甲醇復(fù)溶，得相應(yīng)峰面積 （C）， 每一個質(zhì)量濃度均以 5 樣本進行分析， 內(nèi)標同法考察。 以 A/B（%） 計算提取回收率， B/C（%） 計算基質(zhì)效應(yīng)。氧化芍藥苷、沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩帷?，4-二咖啡酰基奎寧酸、 4，5-二咖啡?；鼘幩?5 個成分的提取回收率為 91.95% ～109.09%， 基質(zhì)效應(yīng)為 91% ～108%，內(nèi)標葛根素提取回收率為 94.31%， 基質(zhì)效應(yīng)為91.64%， 表明均不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 穩(wěn)定性考察 對氧化芍藥苷等 5 種成分低、中、高3個質(zhì)量濃度處理后的血漿樣品在自動進樣器中0、 3、 6 h 及在室溫 （約 20 ℃） 下放置 6 h，4 ℃下冷藏 8 h 和凍融 3 次的穩(wěn)定性 （n=3） 進行了考察， 結(jié)果表明氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡?；鼘幩?、 3，4-二咖啡?；鼘幩帷?4，5-二咖啡?；鼘幩?個成分在各條件下均穩(wěn)定，其RSD%小于 10.05%。

3.6 藥動學(xué)實驗 健康 SD大鼠 6 只， 雌雄各半，體質(zhì)量為 （230 ±10） g， 給 藥前 12 h 禁 食， 自由飲水。取適量辛芍提取物溶于生理鹽水，離心，尾靜脈注射辛芍提取物溶液 34 mg/（mL·kg） 。 于給藥前與給藥后 5、 10、 20、 30、 45、 60、 90、 120、140 min 經(jīng) 尾 靜脈取 血 約 0.35 mL置 涂 有 肝 素 的 塑料離 心 管 中， 5 000 r/min 離 心 10 min， 分 離 血 漿于 -20 ℃冰箱中保存。 實驗所有數(shù)據(jù)均用表示， 采用 DAS 2.0 軟件 （ 中 國 數(shù) 學(xué) 藥 理 專 業(yè) 委 員會）計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，并對藥物在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)過程進行房室模型擬合。氧化芍藥苷等5個成分的 C-t曲線見圖 2，藥動學(xué)參數(shù)見表 3。

圖 2 大鼠靜脈注射辛芍提取物后氧化芍藥苷等 5 種成分的 C-t曲線 （， n=6）Fig.2 Concentration-time profiles of five com ponents after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

表3 氧化芍藥苷等5種成分的主要藥動學(xué)參數(shù) （， n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

表3 氧化芍藥苷等5種成分的主要藥動學(xué)參數(shù) （， n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

矩參數(shù) 單位 氧化芍藥苷 沒食子酸 1，3-二咖啡?；鼘幩?3，4-二咖啡?；鼘幩?4，5-二咖啡?；鼘幩酇UC（0-140min）mg/（ L·min）統(tǒng)計46.83 ±11.15 221.19 ±66.26 27.29 ±22.66 45.87 ±15.26 48.04 ±28.46 AUC（0-∞） mg/（ L·min） 52.12 ±19.58 225.74 ±71.55 28.35 ±22.99 55.39 ±18.88 51.63 ±28.81 MRT（0-140min） min 30.26 ±5.78 29.16 ±2.46 31.01 ±5.18 35.86 ±5.11 32.13 ±9.10 MRT（0-∞） min 51.46 ±48.87 31.05 ±3.45 39.43 ±14.44 63.63 ±36.28 43.38 ±15.81 t1/2z min 16.95 ±11.86 20.99 ±10.18 38.12 ±16.77 57.50 ±36.05 42.80 ±22.29 CLz L/（min·kg） 2.21 ±1.26 0.50 ±0.28 7.41 ±4.22 1.98 ±1.41 2.30 ±1.79 Vz L/kg 54.25 ±33.23 15.11 ±8.91 335.20 ±51.72 173.07 ±92.13 57.84 ±44.33 Zeta 0.04 ±0.02 0.04 ±0.02 0.02 ±0.01 0.02 ±0.01 0.02 ±0.01

4 討論

4.1 本實驗建立了 UPLC-MS 法同時測定大鼠靜脈注射辛芍提取物后的多指標成分的藥代動力學(xué)方法，結(jié)果表明此方法特異、快速、準確、靈敏。

4.2 實驗過程中對多種內(nèi)標進行了考察， 但許多物質(zhì)的出峰時間均與內(nèi)源性物質(zhì)有干擾或出峰時間較晚，最后選擇了黃酮類的葛根素，證明以葛根素為內(nèi)標回收率穩(wěn)定，出峰時間合適，與樣品峰及血漿基質(zhì)無干擾。

4.3 藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果表明： 氧化芍藥苷、 沒食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎寧酸、 3，4-二咖啡?；鼘幩?、 4，5-二咖啡?；鼘幩?5 個成分在大鼠體內(nèi)符合二室藥動學(xué)模型。各物質(zhì)在大鼠體內(nèi)消除較快，這可能與物質(zhì)的理化性質(zhì)有關(guān)， 且各物質(zhì)的藥-時曲線面積相差較大，可能與各物質(zhì)在提取物中的含量和在大鼠體內(nèi)的暴露程度不同有關(guān)。

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Sim ultaneous determ ination of hydroxyl-paeoniflorin， gallic acid and dicaffeoylquinic acid in rat p lasm a by UPLC-MS

ZHENG Lin1，2， TANG Li1， MOU Jing-li1， HUANG Yong1，2， DONG Li1，2， LAN Yan-yu1，2*
（1.School of Pharmacy， Guiyang Medical College， Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM ，Ministry of Education， Guiyang 550004， China； 2.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province， Guiyang 550004， China）

AIM To develop a UPLC-MSmethod for simultaneously determing the contents of hydroxyl-paeoniflorin，gallic acid， 1，3-dicaffeoylquinic acid，3，4-dicaffeoylquinic acid， and 4，5-dicaffeoylquinic acid after intravenous administration of Xinshao extract（ Erigerontis Herba， Paeoniae Radix rubra） in rat plasma.M ETHODS Following a protein precipitation with acidified acetonitrile for plasma samples.The UPLC analysis was performed on Waters Acquity BEH C18column and the mobile phase consisting of acetonitrile and water（ containing 0.1%formic acid） in gradient elution manner.The compounds were ionized in the electrospray ionization ion source of themass spectrometer and detected in the selective ion monitoringmode.RESULTS Good linearity was achieved for the five compounds， the extraction recovery was between 91.95%to 109.09， the intra-and inter-day precisions and the accuracy were good.The five compounds were eliminated in vivo rapidly.CONCLUSION Themethod is specific， sensitive and suitable for the pharmacokinetic studies of the five compounds.

UPLC-MS； pharmacokinetics； Xinshao extract； rat

R969.1

： A

： 1001-1528（2014）05-0937-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.012

2013-06-08

國家自然科學(xué)基金 （81060335）； 貴州省社會發(fā)展攻關(guān)計劃 （黔科合 SY字 ［2011］ 3033 號）； 貴州省科學(xué)技術(shù)基金 （黔科合 J字 ［2012］ 2029 號）； 貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項 （黔科合中藥字 ［2011］ 5081 號）

鄭 林 （ 1981—）， 女， 博 士生， 副教 授， 主 要從事 中 藥 藥 效 物 質(zhì) 基 礎(chǔ) 及 質(zhì) 量 控 制 研 究。 Tel： （ 0851 ） 6908468， E-mail：mailofzl@126.com

*通信作者： 蘭燕宇 （1958—） ， 女， 教授， 主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及新藥研究開發(fā)。 Tel：（0851 ）6908899， E-mail： yanyu626 @126.com