斑馬魚(yú)ca15b的克隆及在原始生殖細(xì)胞中的特異表達(dá)

楊明宇王厚鵬朱作言孫永華

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

斑馬魚(yú)ca15b的克隆及在原始生殖細(xì)胞中的特異表達(dá)

楊明宇1,2王厚鵬1朱作言1孫永華1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

高保真PCR克隆獲得了ca15b基因的全長(zhǎng), 利用胚胎整體原位雜交等技術(shù)研究了ca15b基因在斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), ca15b在斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中存在顯著的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell, PGC)特異表達(dá)模式。ca15b是一個(gè)母源性表達(dá)的基因: 在分裂期的胚胎中, 其mRNA集中分布于位于分裂溝的生殖質(zhì)(Germ plasm); 從囊胚期開(kāi)始, 可以觀察到其在 PGC中的特異表達(dá); 在原腸胚中, 其mRNA在體細(xì)胞中急劇降解, 僅特異表達(dá)于PGC, 這一表達(dá)特征一直持續(xù)到受精后1d的胚胎。將體外合成的包含5′UTR和3′UTR的ca15b全長(zhǎng)mRNA注射到斑馬魚(yú)胚胎后, 僅能增強(qiáng)原腸期之前胚胎中ca15b的整體雜交信號(hào); 在原腸胚期之后, 注射的mRNA在體細(xì)胞中快速降解。這提示在ca15b mRNA上可能存在某種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其在早期胚胎體細(xì)胞中降解而在PGC中穩(wěn)定存在的機(jī)制。

斑馬魚(yú); 原始生殖細(xì)胞; 表達(dá)模式; ca15b

原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell, PGC)在胚胎發(fā)育早期就存在一套與體細(xì)胞完全不一樣的表達(dá)程序[1], 在發(fā)育早期可以被特異地標(biāo)記、分離, 甚至剔除,是開(kāi)展基因操作和胚胎操作的極佳對(duì)象。由PGC發(fā)育而來(lái)的生殖細(xì)胞在成體中獨(dú)立于體細(xì)胞而存在, 經(jīng)過(guò)配子生成的一系列發(fā)育過(guò)程后, 最終產(chǎn)生成熟的配子——卵子和精子, 通過(guò)簡(jiǎn)單的受精過(guò)程即可獲得遺傳上來(lái)源于生殖細(xì)胞或PGC的新生個(gè)體, 從這一角度而言, PGC可以說(shuō)是具有最好全能性的一類(lèi)胚胎細(xì)胞。因此, 在PGC中特異表達(dá)的基因及其表達(dá)調(diào)控規(guī)律受到了越來(lái)越多的關(guān)注[2]。在魚(yú)類(lèi)中, 1997年Yoon, et al.利用斑馬魚(yú)首次克隆鑒定了斑馬魚(yú)原始生殖細(xì)胞特異表達(dá)的基因——果蠅vasa基因的同源基因[3]。斑馬魚(yú)vasa mRNA 是生殖質(zhì)(Germ plasm)的組成部分[4,5], 對(duì)于生殖質(zhì)的形成和生殖細(xì)胞的分化起著重要的作用[6,7]。vasa基因在其他一些魚(yú)類(lèi)(如日本青鳉、虹鱒等)中也得到克隆分析[8,9]。Koprunner, et al.于2001年鑒定出一個(gè)在斑馬魚(yú)的種質(zhì)和PGC中特異表達(dá)的nanos-like (nanos1)基因[10], 他們發(fā)現(xiàn)了幾種能使nanos1只在生殖細(xì)胞里表現(xiàn)出活性的機(jī)制, 包括mRNA的定位, 穩(wěn)定性和翻譯[10]。Gilbert Weidinger, et al. 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在生殖質(zhì)和 PGC中特異表達(dá)的基因dnd[11]。一般而言, PGC特異的mRNA的定位通常是由其3′UTR上的定位元件(Localization elements, LE)來(lái)調(diào)控的, 并且可以被特定的反式作用因子如miRNA等所識(shí)別[12,13]。

我們通過(guò)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索, 發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)家族的一個(gè)新基因——ca15b在斑馬魚(yú)胚胎中可能存在PGC特異表達(dá)。碳酸酐酶是一族含鋅酶[14], 在哺乳動(dòng)物中, 幾乎所有的組織均可檢測(cè)到碳酸酐酶[15]。碳酸酐酶至少有 14種同工酶, 其結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、對(duì)抑制劑的敏感性、組織內(nèi)的分布及亞細(xì)胞的定位均有不同, 已知它們可能參與機(jī)體氣體運(yùn)輸、酸堿調(diào)節(jié)和組織分泌等方面的功能, 在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。本研究克隆鑒定了斑馬魚(yú)的 ca15b基因, 發(fā)現(xiàn)ca15b是一個(gè)在斑馬魚(yú) PGC中特異表達(dá)的新基因,并初步研究了其可能的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

本研究所用實(shí)驗(yàn)魚(yú)為AB品系的野生型斑馬魚(yú)(來(lái)自于國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心, 武漢)。用于顯微注射和原位雜交試驗(yàn)的斑馬魚(yú)胚胎由野生型斑馬魚(yú)雄魚(yú)與雌魚(yú)自然產(chǎn)卵獲得。斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖及胚胎發(fā)育階段定義參考斑馬魚(yú)手冊(cè)[16]。

1.2 斑馬魚(yú)ca15b基因的克隆及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

取斑馬魚(yú)胚盾(Shield)時(shí)期的胚胎 100個(gè), 利用TRIZOL試劑(Invitrigen公司)提取總 RNA。通過(guò)oligo(dT)18反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里預(yù)測(cè)的斑馬魚(yú)ca15b mRNA序列(GenBank登錄號(hào)為NM_213182), 設(shè)計(jì)了能擴(kuò)增出包括5′UTR和3′UTR在內(nèi)的ca15b全長(zhǎng)序列的引物(ca15b-S, ca15b-A)(表1), 預(yù)期產(chǎn)物大小為1.74 kb。我們?cè)谡蛞锷霞由狭?EcoRⅠ酶切位點(diǎn), 在反向引物上加上了 NotⅠ酶切位點(diǎn)。以 shield時(shí)期的胚胎 cDNA為模板, 利用KOD-plus高保真酶(Takara)PCR擴(kuò)增ca15b cDNA的全長(zhǎng)。PCR程序如下: 94℃預(yù)變性5min; 以94 ℃ 30s, 60 ℃ 3 0s, 68 ℃ 1 min 反應(yīng)10個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5 ℃ ; 然后以94 ℃ 30s, 60 ℃ 30s, 68 ℃ 1min 反應(yīng)20個(gè)循環(huán); 最后68℃延伸5min。切膠回收PCR產(chǎn)物后用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pCMV SPORT6.1載體, 然后用T4連接酶16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化, 挑克隆搖菌, PCR鑒定陽(yáng)性克隆,測(cè)序檢測(cè), 獲得pCMV-SPORT6.1- ca15b載體。為考察ca15b的CDs是否參與了ca15b mRNA的表達(dá)調(diào)控, 我們構(gòu)建了 pCS2-ca15bCDs載體。根據(jù) ca15b序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ca15b CDs的引物ca15bCDS-f-EcoRI和ca15bCDS-r-XhoI (表1), 用KOD-plus在pCMVSPORT6.1-ca15b上擴(kuò)增出ca15b CDs, 然后將擴(kuò)出片段和 p CS2+載體同時(shí)用 E coRⅠ和 X hoⅠ雙酶切, 回收酶切產(chǎn)物, 用 T4連接酶連接, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,挑克隆搖菌, PCR鑒定陽(yáng)性克隆, 測(cè)序檢測(cè)。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in the present study

1.3 半定量PCR

分別取斑馬魚(yú)未受精卵及2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、1k細(xì)胞期、圓球(Sphere)時(shí)期、30%外包期、shield時(shí)期、75%外包期、體節(jié)早期、體節(jié)中期和受精后1天(1 day post-fertilization, 1dpf)的胚胎, 提取總RNA, 并按照1.2所述方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以各發(fā)育時(shí)期的cDNA為模板, 用ca15b特異引物(根據(jù)斑馬魚(yú)ca15b基因序列設(shè)計(jì)的引物ca15b-F和ca15b-R, 能擴(kuò)出的片段大小預(yù)期 416 bp)進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè), 以β-actin為內(nèi)參(GenBank登錄號(hào)為NM_181601, 根據(jù)斑馬魚(yú)β-actin基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物β-actin S和β-actin A, 擴(kuò)增片段大小為135 bp)。半定量RT-PCR按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增: 94℃預(yù)變性5min, 然后以94℃ 30s, 54℃ 30s, 72℃ 50s反應(yīng)25個(gè)循環(huán), 再以72℃延伸10min。其中引物序列見(jiàn)表1。

1.4 cDNA和蛋白序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用Vector NTI[17]軟件分析斑馬魚(yú)ca15b的cDNA序列。用SMART在線程序(http://smart.embl-heidelberg. de/)預(yù)測(cè)ca15b的蛋白結(jié)構(gòu)[18]。用CluatalW在線程序[19](http://www.genome.jp/tools/clustalw/)將 Ca15b蛋白序列與幾個(gè)碳酸酐酶家族成員(斑馬魚(yú)Ca15a、Ca15c, 大鼠、小鼠和爪蟾的 Ca15)的蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析并用MEGA 5軟件[20]構(gòu)建蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 mRNA合成及注射

為考察外源ca15b mRNA在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空分布, 我們以 pCMV-SPORT6.1-ca15b載體為模版及載體上的 sp6啟動(dòng)子序列體外轉(zhuǎn)錄包括5′UTR和3′UTR在內(nèi)的ca15b的mRNA。先用 NotⅠ酶切 pCMV-SPORT6.1-ca15b, 作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。用mMESSAGE mMACHINE SP6試劑盒(Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成ca15b的全長(zhǎng)mRNA。另外, 我們還分別用 pCS2-EGFP載體和 pCS2-ca15bCDs載體按上面同樣的方法合成了 EGFP-sv40 mRNA和ca15bCDs-sv40 mRNA。

將合成好的ca15b mRNA、EGFP-sv40 mRNA和ca15bCDs-sv40 mRNA用顯微注射儀按每個(gè)1-細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎注入1 ng樣品[21,22]。

1.6 探針合成與胚胎整體原位雜交

由于pCMV-SPORT-ca15b載體上存在反向的T7啟動(dòng)子, 我們以 EcoRⅠ線性化的 pCMV-SPORT6.1-ca15b載體為模板, 在有地高辛標(biāo)記的UTP (Roche公司)存在的前提下, 以 T7 RNA聚合酶(Omega公司)合成ca15b反義RNA探針。收集在2細(xì)胞期、拱頂(Dome)時(shí)期、shield時(shí)期、1—3體節(jié)期、體節(jié)中期和1 dpf的野生型和注射后的斑馬魚(yú)胚胎, 用4%的甲醛固定, 甲醇脫水, –20℃保存。利用合成的ca15b反義RNA探針對(duì)收集的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行原位雜交。原位雜交主要按照胚胎復(fù)水、蛋白酶消化、預(yù)雜交、雜交、染色和終止等步驟進(jìn)行, 具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[23]。

2 結(jié)果

2.1 ca15b cDNA的克隆和體外轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建

利用 shield時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎 cDNA為模板,我們通過(guò)高保真PCR擴(kuò)增出了片段大小為1.7 kb的ca15b cDNA的目的片段。利用酶切連接的辦法將該片段克隆質(zhì)粒載體 pCMV-SPORT6.1, 測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)所克隆獲得的序列與網(wǎng)絡(luò)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列(GenBank登錄號(hào): BC056289)完全一致。因此, 我們克隆獲得了斑馬魚(yú)的 ca15b全長(zhǎng) cDNA, 同時(shí)構(gòu)建了包含斑馬魚(yú)ca15b基因5′UTR和3′UTR的cDNA的全長(zhǎng)序列的體外轉(zhuǎn)錄載體 pCMV-SPORT6.1-ca15b。此外, 我們將 ca15b的編碼區(qū)亞克隆到pCS2+載體, 獲得僅包含其 CDS的體外轉(zhuǎn)錄載體pCS2-ca15b-sv40。這兩個(gè)載體將用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄和mRNA注射試驗(yàn)。

2.2 Ca15b蛋白序列分析

我們利用SMART在線程序預(yù)測(cè)了Ca15b蛋白的結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn) Ca15b蛋白有存在兩個(gè)主要的潛在的結(jié)構(gòu)域: 位于N-端的碳酸酐酶功能域和位于C-端的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1A)。將推測(cè)的Ca15b蛋白序列與斑馬魚(yú) Ca15a、斑馬魚(yú) Ca15c, 大鼠、小鼠和爪蟾的Ca15等蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析, 發(fā)現(xiàn)Ca15b氨基酸序列上第97—146個(gè)氨基酸之間有三個(gè)保守的組氨酸位點(diǎn)(圖1B)。這三個(gè)組氨酸位點(diǎn)是潛在的鋅離子結(jié)合位點(diǎn), 也是碳酸酐酶的活性區(qū)域[14]。在 Ca15b氨基酸序列上第 263—305個(gè)氨基酸之間有一段 20個(gè)氨基酸左右的片段為潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1B中黑框內(nèi))。這表明, Ca15b蛋白的基本結(jié)構(gòu)域在斑馬魚(yú)和其他脊椎動(dòng)物中保守, 斑馬魚(yú) Ca15b蛋白是一種具有跨膜結(jié)構(gòu)域的碳酸酐酶。

我們用 MEGA程序構(gòu)建蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)Ca15a和Ca15c的蛋白序列相似度最高(圖1C), 相比爪蟾、大鼠和小鼠的Ca15蛋白, 斑馬魚(yú)的Ca15a和Ca15c更接近于斑馬魚(yú)的Ca15b。這提示斑馬魚(yú)基因組中的 3個(gè) Ca15基因是來(lái)自于魚(yú)類(lèi)基因組的復(fù)制加倍。已有的研究表明, Ca15a 在調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)H+-ATPase富集的細(xì)胞中的酸堿平衡和鈉離子濃度方面有非常重要的作用[24]。

2.3 ca15b是一個(gè)母源性表達(dá)的基因并在胚胎發(fā)育過(guò)程中快速降解

通過(guò)搜集斑馬魚(yú)未受精卵、受精卵和早期發(fā)育各時(shí)期的受精卵做半定量RT-PCR, 我們發(fā)現(xiàn)ca15b在胚胎發(fā)育早期都有很高的表達(dá), 并且一直持續(xù) 1k細(xì)胞期。到了shield時(shí)期, ca15b的表達(dá)量迅速降低,至體節(jié)發(fā)育早期之后, 幾乎檢測(cè)不到其可見(jiàn)的表達(dá)(圖2A)。

2.4 ca15b是一個(gè)在斑馬魚(yú) P GC 中特異表達(dá)的新基因

通過(guò)收集斑馬魚(yú)在各個(gè)時(shí)期的胚胎, 用 ca15b探針做原位雜交, 我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)兩細(xì)胞期的胚胎中, ca15b具有很強(qiáng)的表達(dá), 雖然其mRNA分布廣泛, 但在位于分裂溝的生殖質(zhì)中有大量聚集(圖2B)。在shield時(shí)期的胚胎中, 可以發(fā)現(xiàn)ca15b mRNA在體細(xì)胞中發(fā)生大量降解, 但在 PGC中非常穩(wěn)定(圖2C、D)。在發(fā)育到體節(jié)早期的胚胎中, 我們可以清晰地觀察到ca15b mRNA很對(duì)稱(chēng)地分布在背脊的兩側(cè)的原始生殖細(xì)胞中(圖2E、F)。在發(fā)育到1 dpf的胚胎中, ca15b的mRNA在PGC依然穩(wěn)定存在(圖2G、H)。原位雜交的結(jié)果表明, 斑馬魚(yú)ca15b是一個(gè)典型的PGC特異表達(dá)的新基因。

2.5 外源注射的 ca15b mRNA在斑馬魚(yú)原腸胚后的體細(xì)胞中迅速降解

圖1 斑馬魚(yú)Ca15b蛋白結(jié)構(gòu)、序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Protein structure, sequence analysis and phylogenetic tree of zebrafish Ca15b

為 了 研 究 ca15b mRNA在體細(xì)胞中急劇降解且在PGC中穩(wěn)定存在的機(jī)制, 我們體外合成了包含3′UTR和5′UTR的ca15b mRNA, 向斑馬魚(yú)受精卵注射大量ca15b mRNA (每胚胎1 ng mRNA), 收取不同發(fā)育時(shí)期的胚胎, 用 ca15b探針做原位雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在shield時(shí)期, 相比野生型胚胎, ca15b mRNA的存在量有較高水平的提高(圖3A)。但是到了體節(jié)早期, 體細(xì)胞中的ca15b mRNA依然被大量降解, 僅能在 PGC中檢測(cè)到其特異的表達(dá)信號(hào)(圖3B)。而在平行注射的GFP-sv40 mRNA樣品中,我們觀察到注射的GFP-sv40 mRNA能夠在發(fā)育到體節(jié)中期的胚胎中依然非常穩(wěn)定地被檢測(cè)到(圖3C、 D)。這一結(jié)果提示, 在ca15b全長(zhǎng)mRNA上存在著某種令其在體細(xì)胞中急劇降解而在PGC中穩(wěn)定存在的作用元件。

2.6 在 ca15b mRNA上控制其PGC穩(wěn)定性的元件位于其編碼區(qū)

為了探討這種作用元件位于ca15b mRNA的哪部分區(qū)段, 我們將 ca15b編碼區(qū)的 cDNA與 sv40 polyA信號(hào)相串聯(lián), 將體外合成的 ca15bCDs-sv40mRNA顯微注射入斑馬魚(yú)受精卵, 利用ca15b探針對(duì)胚胎進(jìn)行原位雜交分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 雖然在發(fā)育到shield時(shí)期的胚胎中, ca15b的原位雜交信號(hào)在體細(xì)胞中顯著增強(qiáng)(圖 3E), 但在發(fā)育到體節(jié)中期的胚胎中, 其原位雜交信號(hào)在體細(xì)胞中完全消失, 僅在PGC中被檢測(cè)到(圖3F)。這提示我們?cè)赾a15b mRNA的編碼區(qū)(CDS)上存在令其 mRNA在體細(xì)胞中極不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。

圖2 ca15b在斑馬魚(yú)早期胚胎中的PGC特異表達(dá)Fig. 2 PGC-specific expression of ca15b in zebrafish embryos

我們通過(guò)用Vector NTI軟件的motif analysis程序分析ca15b的序列發(fā)現(xiàn), ca15b全長(zhǎng)cDNA上存在5個(gè)與miRNA430識(shí)別位點(diǎn)核心序列GCACTTT相類(lèi)似的序列(正義鏈2個(gè), 反義鏈3個(gè)), 其中有1個(gè)位點(diǎn)位于ca15b基因的CDs區(qū)(圖3G)。

3 討論

得益于國(guó)際斑馬魚(yú)信息網(wǎng)絡(luò)(ZFIN)提供的高通量基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zfin.org/cgi-bin/webdriver? MIval=aa-xpatselect.apg), 我們搜索到ca15b這樣一個(gè)可能在斑馬魚(yú)PGC中存在特異表達(dá)的基因。通過(guò)分子克隆、序列特征分析、基于 RT-PCR和原位雜交的表達(dá)分析等手段, 確認(rèn)了 ca15b是在斑馬魚(yú)PGC中存在特異表達(dá)一個(gè)新基因。截止2013年11月, ZFIN提供了一萬(wàn)兩千多個(gè)基因的高通量表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù), 這不僅可以為尋找斑馬魚(yú)特定組織和細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因提供方便, 而且為挖掘在感興趣的組織中特異表達(dá)的新基因提供了一個(gè)有力的平臺(tái)。

圖3 決定斑馬魚(yú)ca15b的PGC特異元件位于其編碼區(qū)Fig. 3 PGC-specified element locates in the coding region of zebrafish ca15b mRNA

通過(guò)對(duì)ca15b基因在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量的半定量RT-PCR分析, 考察了ca15b基因在發(fā)育時(shí)序中的相對(duì)表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)它在未受精卵中有高水平的表達(dá), 由此可知 ca15b mRNA是斑馬魚(yú)卵細(xì)胞所提供的母源因子的組成部分。斑馬魚(yú)ca15b在受精之后到30%外包期都存在高水平的表達(dá), 直到shield時(shí)期表達(dá)水平出現(xiàn)驟降。從shield時(shí)期開(kāi)始直到1 dpf的胚胎, ca15b的表達(dá)都維持在一個(gè)較低的水平。這些表達(dá)特征與斑馬魚(yú)中另一個(gè)PGC特異的基因HuB(elavl2)完全一致[25],提示這兩個(gè)基因可能存在著類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。利用胚胎整體原位雜交技術(shù), 觀察到ca15b mRNA在兩細(xì)胞期主要分布于位于斑馬魚(yú)胚胎分裂溝的生殖質(zhì)中, 除此之外, 在胚盤(pán)的其他部位也存在雜交信號(hào)的均勻分布, 這是因?yàn)閏a15b mRNA是一種卵細(xì)胞質(zhì)所提供的母源因子。從shield時(shí)期開(kāi)始, ca15b mRNA從體細(xì)胞中完全消失, 只穩(wěn)定存在于原始生殖細(xì)胞中。這一表達(dá)特征與其他已深入研究過(guò)的斑馬魚(yú)PGC特異基因的表達(dá)模式非常一致。本研究發(fā)現(xiàn)了斑馬魚(yú) PGC特異表達(dá)的一個(gè)新基因ca15b, 并揭示了其PGC特異的表達(dá)模式。

出于對(duì)ca15b mRNA在體細(xì)胞中迅速降解的機(jī)制產(chǎn)生的好奇, 我們向斑馬魚(yú)胚胎胚胎注射了大量的外源 ca15b mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 雖然體外注射的ca15b mRNA可以在shield時(shí)期大大增強(qiáng)ca15b的雜交信號(hào), 但是到了原腸晚期之后, 特別是在體節(jié)發(fā)育早期, 外源注射的 ca15bmRNA從斑馬魚(yú)體細(xì)胞中完全消失, 只特異存在于斑馬魚(yú)的 PGC。而在平行注射EGFP-sv40 mRNA的樣品中, 可以觀察到外源注射的mRNA一直穩(wěn)定存在到體節(jié)發(fā)育中期的胚胎中。這表明, 在ca15b全長(zhǎng)mRNA上存在某種令其在體細(xì)胞中降解, 且在 PGC中穩(wěn)定的作用元件。為了進(jìn)一步弄清斑馬魚(yú)ca15b轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制, 我們將ca15bCDs-sv40 mRNA通過(guò)顯微注射注入斑馬魚(yú)受精卵, 然后用 ca15b探針進(jìn)行原位雜交發(fā)現(xiàn), 到了 shield時(shí)期原位雜交信號(hào)都很強(qiáng), 到了體節(jié)中期原位雜交的信號(hào)在體細(xì)胞中完全降解, 僅在PGC中被檢測(cè)到。這里所用的sv40 polyA是一種能將 mRNA廣泛定位和穩(wěn)定的 UTR[26], 這表明在ca15b mRNA的編碼區(qū)(CDS)上存在令mRNA在體細(xì)胞中極不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件, 即使這種mRNA攜帶有sv40的polyA信號(hào), 也不足以使這種融合mRNA在體細(xì)胞中穩(wěn)定存在。

調(diào)節(jié) mRNA穩(wěn)定的順式作用元件一般位于其3'UTR, 例如nanos mRNA的3′UTR上面有miRNA的作用位點(diǎn), 能夠使其mRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控只存在于PGC[27—29]。斑馬魚(yú)miR430在母源mRNA的清除過(guò)程中扮演了重要角色[30], 因此我們重點(diǎn)考察了ca15b cDNA上是否存在與miR430相匹配的潛在作用位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ca15b上有5個(gè)位點(diǎn)(正義鏈2個(gè)、反義鏈3個(gè), 其中只有1個(gè)在CDs區(qū))與miR430的核心作用序列僅存在一個(gè)堿基的差異。這些位點(diǎn)將成為對(duì)ca15b開(kāi)展轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究的重點(diǎn)考察對(duì)象。通常原始生殖細(xì)胞特異的 mRNA在體細(xì)胞和PGC的不同穩(wěn)定性是由 miRNA(如斑馬魚(yú)中的miRNA430和爪蟾中的miRNA18等)[31]介導(dǎo)的在體細(xì)胞降解作用和原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白(如Elr、Dazl等)[25]介導(dǎo)的在PGC的保護(hù)作用共同實(shí)現(xiàn)的。蛋白對(duì)mRNA的保護(hù)作用主要是通過(guò)抑制miRNA跟mRNA結(jié)合或抑制mRNA的去腺苷酸化這兩種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[30,32]。將 ca15b mRNA 的3′UTR替換為一個(gè)能使mRNA不被高效去腺苷酸化的UTR(sv40)之后, 它仍在體細(xì)胞和PGC表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性, 這說(shuō)明ca15b mRNA在PGC能夠穩(wěn)定存在很有可能是因?yàn)橛械鞍滓种屏颂囟?miRNA(如miRNA430)與它的結(jié)合。

一般而言, 在PGC特異表達(dá)的基因?qū)GC的存活或者發(fā)育有著重要的功能。譬如, Vasa蛋白是DEAD-box 蛋白家族的重要成員[33,34], 是決定生殖系發(fā)育的重要調(diào)控因子之一; Nanos在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中是必須的[35—38], nanos基因的突變會(huì)導(dǎo)致性腺中的極細(xì)胞不能正常遷移, 也無(wú)法形成生殖細(xì)胞, 并在胚胎發(fā)生過(guò)程中大量死亡[39]; 斑馬魚(yú) dnd基因?qū)τ谠忌臣?xì)胞的存活也是必需的[11,40], 斑馬魚(yú)dnd RNA是生殖質(zhì)的組成部分并且特異的在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)[32]。已經(jīng)深入研究的魚(yú)類(lèi)PGC特異表達(dá)基因所翻譯的蛋白多為 RNA結(jié)合蛋白或RNA互作蛋白, 他們的功能與生殖質(zhì)的形成、生殖細(xì)胞的形成和遷移相關(guān)[2]。斑馬魚(yú)ca15b作為在PGC特異表達(dá)的基因, 它所編碼的蛋白為在PGC中特異表達(dá)的一類(lèi)全新的蛋白——碳酸酐酶。已有研究表明Ca15a在調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)H+-ATPase富集的細(xì)胞中的酸堿平衡和鈉離子濃度方面有非常重要的作用[24],斑馬魚(yú) Ca15a和 Ca15b的重要功能域存在保守性,所以我們推測(cè) Ca15b蛋白可能存在類(lèi)似的功能。ca15b在斑馬魚(yú)PGC發(fā)育中有什么重要的作用將是一個(gè)值得深入研究的課題。

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CLONING, IDENTIFICATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF CA15B, A NOVEL GENE SPECIFICALLY EXPRESSED IN PRIMORDIAL GERM CELLS OF ZEBRAFISH

YANG Ming-Yu1,2, WANG Hou-Peng1, ZHU Zuo-Yan1and SUN Yong-Hua1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Primordial germ cells (PGCs) are the ancestor cells of adult gametes at embryonic stage. PGCs-specific gene expression plays a fundamental role in germ cell induction, development, migration and differentiation. Understanding the functional role of PGCs-specifically expressed genes could provide us some tools to perform gene and embryo manipulations. Screening a public database of zebrafish (http://www.zfin.org) we found a PGCs-specific candidate gene, carbonic anhydrase 15b (ca15b). To confirm this, whole-mount in situ hybridization and other technologies were utilized to analyze the expression of ca15b during zebrafish early development. We observed that ca15b is a maternally expressed gene and it is highly expressed in germ plasm during cleavage stage. The expression of ca15b at mRNA level was specifically detected in the PGCs at blastula stage. At gastrula stage, ca15b is still strictly expressed in PGCs while its expression is undetectable in somatic cells. This specific expression pattern of ca15b persisted until one day post-fertilization. More importantly, the post-transcriptional regulation elements that mediate PGCs-specific expression of ca15b may locate in its coding sequence.

Zebrafish; Primordial germ cells; Expression pattern; ca15b

Q344+.1

A

1000-3207(2014)01-0142-08

10.7541/2014.19

2012-12-03;

2013-10-14

國(guó)家科技部973計(jì)劃課題(2010CB126306); 國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金(31222052)資助

楊明宇(1987—), 男, 四川遂寧人; 碩士; 主要從事魚(yú)類(lèi)遺傳學(xué)研究。E-mail: myysss87@gmail.com

孫永華, E-mail: yhsun@ihb.ac.cn