細(xì)胞內(nèi)吞和自噬的新標(biāo)志物VCP/p97

劉中洋，劉艷，襲榮剛，王曉波

1.沈陽(yáng)軍區(qū) 藥物研究所，遼寧 大連 116015；2.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116015

含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）是與多種細(xì)胞活性相關(guān)的三磷酸腺苷酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）中的一員，是糖基磷脂酰肌醇連接的轉(zhuǎn)鐵蛋白同系物，又稱黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白或p97，參與核酸的重建、膜損傷、細(xì)胞周期調(diào)控等重要細(xì)胞活動(dòng)，具有激活NFκB、抗細(xì)胞凋亡、啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子及促進(jìn)細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)等作用[1-2]。

p97蛋白在許多泛素化依賴的過(guò)程中扮演著中心分子的角色[3-4]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)的降解過(guò)程中的p97分子功能研究得最清楚[5]。ER中錯(cuò)誤折疊的蛋白被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)，并在此進(jìn)行泛素化修飾。p97與其輔因子UFD1-NPL4形成復(fù)合物，之后與泛素化蛋白結(jié)合，并且將它們從質(zhì)膜上提取出來(lái)以促進(jìn)其向蛋白酶體的傳送。同樣，p97-UFD1-NPL4復(fù)合物也介導(dǎo)多聚泛素蛋白從染色質(zhì)中分離出來(lái)，在某些情況下這些蛋白也被轉(zhuǎn)移至蛋白酶體[5-6]。在調(diào)控轉(zhuǎn)錄、DNA損傷應(yīng)答及細(xì)胞周期過(guò)程中，p97-Ufd1-Npl4的染色質(zhì)相關(guān)活性至關(guān)重要，是維持增殖細(xì)胞基因穩(wěn)定性的必需物[7-8]。

除了p97-UFD1-NPL4之外，p97還能與具有其他細(xì)胞功能的輔因子形成復(fù)合物[5,9]。這些輔因子大都含有UBX或UBX樣的泛素化折疊結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)其與p97蛋白的結(jié)合[10]。p97與含有UBX結(jié)構(gòu)域（包括p47或其同源物p37）結(jié)合成復(fù)合物，指導(dǎo)有絲分裂和調(diào)控高爾基體的改造[11]。p97-p47依賴的反應(yīng)是泛素依賴性的，并且需要p47的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和去泛素化酶VCIP135的存在[12]。雖然迄今泛素化的靶標(biāo)仍未確定，但依然表明p97在這些過(guò)程中“管理”著一個(gè)重要的調(diào)控步驟[13]。此外，近年來(lái)許多研究將p97與膜介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸和自噬聯(lián)系在一起。有趣的是，這2條途徑不是通過(guò)蛋白酶體而是通過(guò)向溶酶體運(yùn)送物質(zhì)進(jìn)行降解。

1 胞內(nèi)運(yùn)輸及其泛素化調(diào)控

細(xì)胞的內(nèi)吞作用受許多不同機(jī)制的調(diào)控[14-15]。細(xì)胞外的物質(zhì)和部分質(zhì)膜蛋白被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)小泡進(jìn)而形成早期的胞內(nèi)體，之后膜蛋白或者被質(zhì)膜回收再利用，或者被運(yùn)送至晚期的胞內(nèi)體和溶酶體進(jìn)行降解[16]。目前，研究最深的是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[17]。以復(fù)雜的信號(hào)傳遞事件開(kāi)始，可溶的成分（包括網(wǎng)格蛋白）在細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)形成一個(gè)膜外套以及集中要運(yùn)輸?shù)摹柏浳铩薄４送?，還有窖蛋白（caveolin，Cav）-1及Cav-1的同系物介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸[18-19]。與網(wǎng)格蛋白相反，Cav-1是一種具有能夠插入質(zhì)膜的胞質(zhì)小葉的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)膜蛋白，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞膜窖（caveolae）。

研究表明，內(nèi)吞小泡融合形成早期的胞內(nèi)體是受小GTP酶Rab5和它的效應(yīng)器，如早期胞內(nèi)抗原（EEA1）調(diào)控的[20-21]。招募的分子運(yùn)至胞內(nèi)體膜后，能夠與Rab5效應(yīng)蛋白、Rabaptin-5、Rabex-5及膜融合因子NSF裝配成大分子復(fù)合物[22]。Rab5也能招募磷脂酰肌醇-3激酶Vps34/p150，從而標(biāo)記早期的胞內(nèi)體。在成熟至晚期的胞內(nèi)體過(guò)程中，Rab5被Rab7替換[16]。

轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sort?ing complex required for transport，ESCRT）是指一系列的四蛋白復(fù)合物（ESCRT-0至ESCRT-Ⅲ），跨膜蛋白從胞內(nèi)體向溶酶體的選擇性運(yùn)輸過(guò)程受ES?CRT蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)[23-24]。ESCRT復(fù)合物的連續(xù)能夠激活調(diào)節(jié)綁定物質(zhì)的濃度、胞內(nèi)小泡的形成以及將物質(zhì)分揀至這些小泡，最后ESCRT復(fù)合物組分ATP酶超家族的VPS4回收再利用[25-26]。胞內(nèi)體膜結(jié)合之后形成的細(xì)胞器，也就是我們所說(shuō)的多泡體，在細(xì)胞核的周?chē)c溶酶體融合之后，囊泡的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組分被酸性水解酶降解[27]。其中糖蛋白LAMP1仍然留在膜上，成為晚期胞內(nèi)體或溶酶體的標(biāo)記物。

不管是內(nèi)吞作用還是多泡體的形成都涉及高度調(diào)控及蛋白質(zhì)相互作用。以單泛素、多泛素或短賴氨酸63連接的多聚泛肽鏈等形式的泛素修飾，在物質(zhì)分選和調(diào)控分選機(jī)器中扮演重要角色[28]。在質(zhì)膜上物質(zhì)的泛素化起內(nèi)化信號(hào)（如epsin或EPS15）的作用。然而，分選機(jī)器的組分包括epsin本身也被泛素化，進(jìn)而參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[29]?？傊核鼗膭?dòng)態(tài)性和泛素管理的相互作用網(wǎng)絡(luò)受到特殊的泛素連接酶和去泛素化酶的調(diào)控[30]。

2 VCP/p97在胞吞途徑中的作用

上世紀(jì)90年代，Pleasure等首次發(fā)現(xiàn)p97參與內(nèi)吞作用，并與內(nèi)吞小泡膜組件蛋白相互作用[31]。然而，p97對(duì)內(nèi)吞作用功能性的影響及其與內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系仍待進(jìn)一步的研究。2011年，Ramanathan和Ritz分別在自己的研究中揭示了p97與內(nèi)吞作用的新聯(lián)系，又一次證明了p97與胞吞途徑的組分發(fā)生物理作用[32-33]。

p97在胞吞途徑的一些步驟中扮演著什么樣的角色？它的功能是什么？已證明在各種途徑中p97能夠提取泛素修飾的靶蛋白[3-4]；相反，泛素化廣泛參與胞吞途徑不但擔(dān)任著“貨物”蛋白分選信號(hào)的功能，還調(diào)節(jié)著內(nèi)吞機(jī)器的活性和相互作用[28]。同樣，Carvalho等認(rèn)為p97可能不僅在ER相關(guān)的降解過(guò)程中直接綁定和提取泛素化底物，而且還可能在結(jié)構(gòu)上改造運(yùn)輸機(jī)器以提高底物的運(yùn)輸效率[34]。然而迄今的研究數(shù)據(jù)表明，p97在胞內(nèi)體中的作用是非蛋白酶體依賴性的，但并不完全排除蛋白酶體的參與。也有報(bào)道稱交叉遞呈過(guò)程中，胞內(nèi)體中底物多聚泛素化會(huì)招募p97，將底物提取出來(lái)運(yùn)送至蛋白酶體，并在此進(jìn)行抗原遞呈處理[35]。

此外，p97參與胞內(nèi)運(yùn)輸也有醫(yī)學(xué)相關(guān)性。p97點(diǎn)突變?cè)斐娠@性遺傳累及多系統(tǒng)的退行性疾病，稱為包涵體肌病與Paget骨和額顳癡呆（inclusion body myopathy with Paget's disease of bone and fronto-temporal dementia，IBMPFD）[36-37]。值得注意的是，疾病相關(guān)的突變特異性地廢除了p97與其輔因子如UBXD1的相互作用，但對(duì)UFD1-NPL4或p47無(wú)效[33,38]，同時(shí)也影響了Cav-1的綁定[33]。這表明，細(xì)胞內(nèi)吞作用缺陷可能有助于該疾病發(fā)病機(jī)理的研究。同時(shí)，雖然ER相關(guān)的降解并沒(méi)有受損，但自噬也受到疾病相關(guān)的p97突變的影響[32,39]。提示p97與自噬的功能和胞內(nèi)運(yùn)輸有一定的聯(lián)系。

3 自噬中的VCP與胞內(nèi)運(yùn)輸潛在的聯(lián)系

自噬是降解大分子結(jié)構(gòu)如細(xì)胞器和蛋白聚集物的過(guò)程。自噬起始于雙層膜的形成，該雙層膜是由泛素樣蛋白LC3（LC3-Ⅱ）的脂類形式標(biāo)記，之后吞噬細(xì)胞組分形成自噬體。根據(jù)降解的物質(zhì)不同，可將自噬分為大自噬、核糖體自噬、線粒體自噬及微自噬[40-43]。在許多情況下要降解的物質(zhì)與泛素結(jié)合，在自噬體膜上通過(guò)特殊的銜接蛋白p62和NBR1與LC3-Ⅱ銜接起來(lái)[44]。自噬體最終與溶酶體結(jié)合，對(duì)大分子物質(zhì)進(jìn)行降解[45]。

Ju等在p97相關(guān)疾病IBMPFD中首次揭示p97參與自噬過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)病人組織切片中富含泛素和自噬標(biāo)志蛋白p62及LC3B的泡狀結(jié)構(gòu)[46]，在表達(dá)疾病相關(guān)的p97轉(zhuǎn)基因小鼠及組織培養(yǎng)的細(xì)胞（p97突變或siRNA干擾p97缺陷）中也得到驗(yàn)證[47-48]。目前已有許多研究表明p97在自噬中的作用[49]。Weihl等發(fā)現(xiàn)在p97缺乏時(shí)自噬體和溶酶體的融合受到抑制[46]；Taylor等發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶D陽(yáng)性的自噬體中，p97只在自噬體和溶酶體融合之后發(fā)揮作用[39]。與哺乳類動(dòng)物相比，酵母菌的p97同系物Cdc48及其輔因子Shp1（哺乳動(dòng)物p47的同系物）是自噬體形成過(guò)程中所必需的，同時(shí)在自噬過(guò)程中Shp1和Atg8（LC3的同系物）可以直接相互作用[50]。此外，在核糖體自噬過(guò)程中去泛素化的復(fù)合物UBP3-BRE5通過(guò)與p97及其輔因子UFD3形成三重復(fù)合物，從而扮演著十分關(guān)鍵的角色[51]。然而在線粒體自噬過(guò)程中可能存在不同的機(jī)制。有文獻(xiàn)表明，p97幫助蛋白酶體依賴的線粒體融合蛋白降解[52]。從酵母菌中獲得的數(shù)據(jù)也表明，細(xì)胞核的零碎微自噬需要Cdc48及其輔因子Shp1的存在[53]。總之，細(xì)胞核周?chē)奂w的形成及聚集蛋白的清除，也是p97的重要功能之一。

4 結(jié)語(yǔ)

越來(lái)越多的資料已顯示p97參與了胞內(nèi)運(yùn)輸和自噬，現(xiàn)在最重要的是理解在這些細(xì)胞過(guò)程中p97的基礎(chǔ)分子機(jī)制。此外，p97可能參與形成更大的功能復(fù)合物，諸如膜錨定的招募因子、泛素連接酶、去泛素化酶等。對(duì)p97更深入的研究分析將有助于理解這些細(xì)胞進(jìn)程。

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