斑馬魚(yú)模型在藥物早期安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

劉可春，孫晨，王希敏，侯海榮

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014）

*藥理與毒理專欄*

斑馬魚(yú)模型在藥物早期安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

劉可春，孫晨，王希敏，侯海榮

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014）

在藥物研發(fā)領(lǐng)域，建立經(jīng)濟(jì)、有效的藥物早期安全性評(píng)價(jià)技術(shù)已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的迫切需求。斑馬魚(yú)作為常用的三大模式動(dòng)物之一，是一種理想的藥物早期安全性評(píng)價(jià)模型。采用該模型對(duì)新藥進(jìn)行早期安全性評(píng)價(jià)可以提高藥物早期毒性預(yù)測(cè)的可靠性和靈敏度，縮短新藥研發(fā)周期，降低新藥研發(fā)成本，提高新藥研發(fā)成功率。本文綜述了斑馬魚(yú)模型在藥物早期安全性評(píng)價(jià)，如一般毒性評(píng)價(jià)、發(fā)育毒性評(píng)價(jià)、神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)、器官毒性評(píng)價(jià)、生殖毒性評(píng)價(jià)等中的作用。隨著生物與醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，斑馬魚(yú)在藥物研發(fā)的早期安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用，并推動(dòng)藥物研發(fā)的進(jìn)程。

斑馬魚(yú)；藥物早期安全性評(píng)價(jià)；毒性評(píng)價(jià)

在藥物發(fā)現(xiàn)與臨床前研究階段，有40%左右的藥物由于毒性和安全性等問(wèn)題被淘汰；在藥物臨床試驗(yàn)階段，又有約60%左右的藥物因肝臟、心臟或是神經(jīng)毒性被終止臨床試驗(yàn)。1975—2007年間，47種藥物由于具有明顯副作用而退出市場(chǎng)［1］。因此，建立經(jīng)濟(jì)、有效的藥物早期安全性評(píng)價(jià)技術(shù)已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外新藥研發(fā)領(lǐng)域的迫切需求，“早發(fā)現(xiàn)、早淘汰”已成為國(guó)內(nèi)外新藥研發(fā)界的新理念。在藥物研發(fā)的臨床前實(shí)驗(yàn)階段，通常以細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和藥物安全性評(píng)價(jià)。該方法雖然具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但是其篩選結(jié)果種屬差異性較大，并且不是在機(jī)體水平對(duì)藥物安全性進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。所以，在藥物研發(fā)過(guò)程中，利用相應(yīng)的動(dòng)物模型，在機(jī)體內(nèi)部對(duì)藥物進(jìn)行快速、有效的早期安全性評(píng)價(jià)具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的新藥臨床前體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)一般采用嚙齒類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，該方法雖然具有結(jié)果可靠、綜合全面等優(yōu)點(diǎn)，但是其成本較高，并且不適合于高通量的藥物篩選與毒性機(jī)制的研究。因此急需一種既具有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的高通量性和經(jīng)濟(jì)性，又具有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的可靠性和全面性等優(yōu)勢(shì)的模式動(dòng)物。本文就斑馬魚(yú)模型在一般毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性和生殖毒性等評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在將斑馬魚(yú)模型與藥物早期安全性評(píng)價(jià)相結(jié)合，以便提高新藥研發(fā)的效率和安全性，降低新藥研發(fā)的成本，從而更好地推動(dòng)藥物研發(fā)進(jìn)程。

1 斑馬魚(yú)的生物學(xué)特點(diǎn)及其在藥物早期安全性評(píng)價(jià)中的優(yōu)勢(shì)

在生命科學(xué)領(lǐng)域，斑馬魚(yú)（zebrafish，Danio rerio）作為一種常用的模式動(dòng)物，正可以彌補(bǔ)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各種不足。斑馬魚(yú)與人類基因具有高達(dá)87%的同源性［2－3］，其信號(hào)傳導(dǎo)通路、生理結(jié)構(gòu)與功能等均與哺乳動(dòng)物高度相似［4］，這意味著用斑馬魚(yú)開(kāi)展藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。同時(shí)，斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，它能準(zhǔn)確反映待測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄等動(dòng)態(tài)生理過(guò)程。所以，利用斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物早期安全性評(píng)價(jià)時(shí)，其結(jié)果比體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)更可靠。

斑馬魚(yú)是一種小型的熱帶魚(yú)類，對(duì)生存的水環(huán)境要求不高，培養(yǎng)水的pH值在6.8～7.8之間、水溫25～31℃。斑馬魚(yú)卵徑約為1～1.5 mm，幼魚(yú)體長(zhǎng)約1～4 mm，成魚(yú)體長(zhǎng)約3 cm，體呈紡錘形，稍側(cè)扁，體側(cè)從頭至尾遍布藍(lán)色條紋。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)成本低，繁殖周期短，孵出后約3個(gè)月可達(dá)到性成熟，5個(gè)月可到達(dá)體成熟。一年四季均可產(chǎn)卵，雌魚(yú)每次產(chǎn)卵可多達(dá)200～300枚。斑馬魚(yú)體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明且發(fā)育快速，胚胎在24 h內(nèi)即可發(fā)育成型。體外受精約120 hpf（hours post fertilization，受精后小時(shí)）后，各個(gè)組織和器官，例如腦、心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)等均可發(fā)育完全。斑馬魚(yú)胚胎和出膜后約7 dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）的幼魚(yú)均可以依靠卵黃獲取營(yíng)養(yǎng)，氧氣或水中的小分子物質(zhì)可以通過(guò)膜或是皮膚進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)［5］。斑馬魚(yú)的以上特點(diǎn)均顯示，與其他模式動(dòng)物相比，利用斑馬魚(yú)進(jìn)行體內(nèi)藥物安全性評(píng)價(jià)，具有以下優(yōu)勢(shì)：藥物用量少，給藥方便、便于觀察和操作、藥物篩選周期縮短、實(shí)驗(yàn)成本低以及可實(shí)現(xiàn)高通量篩選，同時(shí)還方便對(duì)藥物的毒性機(jī)理進(jìn)行研究。斑馬魚(yú)幼魚(yú)是目前為止唯一適合微孔板高內(nèi)涵、高通量和全自動(dòng)化分析的脊椎動(dòng)物模型。除此之外，在以動(dòng)物模型為研究對(duì)象進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)時(shí)，研究人員需要充分考慮動(dòng)物保護(hù)條例等問(wèn)題，但人們通常不將受精120 hpf前的斑馬魚(yú)胚胎看成是動(dòng)物個(gè)體［6］，因此從這一角度看，在藥物早期安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚(yú)與嚙齒類模式動(dòng)物相比，也具有明顯優(yōu)勢(shì)。

由于斑馬魚(yú)具有以上多種優(yōu)勢(shì)，引起了生物技術(shù)與制藥領(lǐng)域的高度關(guān)注，并且已被廣泛應(yīng)用到藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)當(dāng)中。20世紀(jì)七、八十年代，世界上只有少數(shù)幾家實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)可以作為模式動(dòng)物應(yīng)用于生物研究。隨后，由于研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物的發(fā)育進(jìn)程、基因調(diào)控模式等均高度保守，所以斑馬魚(yú)日益受到生物制藥領(lǐng)域的關(guān)注，并被逐步應(yīng)用于藥物早期安全性評(píng)價(jià)當(dāng)中。目前，斑馬魚(yú)已被列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物，其基因組的多種遺傳標(biāo)記與基因芯片已經(jīng)商品化。歐洲斑馬魚(yú)藥物篩選技術(shù)服務(wù)公司于2009年獲得了美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）和歐洲藥品評(píng)估局（EMEA）的GLP認(rèn)證，這標(biāo)志著斑馬魚(yú)藥物毒理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)模型已經(jīng)得到了歐美國(guó)家政府的正式認(rèn)可。目前，斑馬魚(yú)模型已被廣泛應(yīng)用于一系列的藥物安全性評(píng)價(jià)當(dāng)中，美國(guó)和歐洲共有約2 000多家機(jī)構(gòu)從事斑馬魚(yú)相關(guān)的基礎(chǔ)及應(yīng)用基礎(chǔ)性研究，有9家斑馬魚(yú)新藥篩選公司已面向全球范圍提供商業(yè)化服務(wù)［7］。斑馬魚(yú)模型已被廣泛應(yīng)用于包括一般毒性評(píng)價(jià)、發(fā)育毒性評(píng)價(jià)、神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)、靶器官毒性評(píng)價(jià)、生殖毒性評(píng)價(jià)和局部毒性評(píng)價(jià)等在內(nèi)的一系列藥物毒性和安全性評(píng)價(jià)當(dāng)中。

2 斑馬魚(yú)模型在一般毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

一般毒性評(píng)價(jià)包括急性毒性評(píng)價(jià)和長(zhǎng)期毒性評(píng)價(jià)兩部分。急性毒性指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24 h內(nèi)單次或是多次大劑量給予某種藥物所表現(xiàn)的有害作用。早在1984年，經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織（OECD）的指導(dǎo)手冊(cè)就已經(jīng)將斑馬魚(yú)列為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)類，并應(yīng)用于化合物的急性毒性檢測(cè)。長(zhǎng)期毒性則指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸較大劑量的藥物所引起的中毒效應(yīng)。藥物的一般毒性評(píng)價(jià)可以在斑馬魚(yú)的不同發(fā)育階段分別進(jìn)行。將待測(cè)藥物分別定量、定時(shí)作用于斑馬魚(yú)的胚胎、幼魚(yú)和成魚(yú)期，隨后可以在顯微鏡下直接觀察卵黃囊水腫情況、卵凝結(jié)情況、色素形成、尾巴部延展和體節(jié)形成等，并且統(tǒng)計(jì)孵化率、致畸率、死亡率和LD50等數(shù)據(jù)，同時(shí)還可以記錄斑馬魚(yú)主要畸形特征［8－9］。根據(jù)已有數(shù)據(jù)顯示，利用斑馬魚(yú)胚胎檢測(cè)非致畸化合物的成功率可達(dá)75%，檢測(cè)致畸化合物的成功率更是高達(dá)100%［10］。

3 斑馬魚(yú)模型在發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)胚胎透明，體外發(fā)育，最早即是作為模式生物應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)領(lǐng)域。自20世紀(jì)50年代開(kāi)始，Hisaoka等［11］即開(kāi)始將斑馬魚(yú)應(yīng)用于毒理學(xué)研究領(lǐng)域，并且發(fā)現(xiàn)巴比妥酸和二乙巴比妥酸等均會(huì)影響斑馬魚(yú)的正常發(fā)育。在斑馬魚(yú)的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，其很多器官和系統(tǒng)，例如心血管、肝臟、腦、腎臟和軟骨等的形成過(guò)程均對(duì)藥物的介入非常敏感，并且極易產(chǎn)生畸形。斑馬魚(yú)在心血管有嚴(yán)重畸形的情況下還可以存活并繼續(xù)發(fā)育較長(zhǎng)時(shí)間，所以是評(píng)價(jià)藥物發(fā)育毒性的有效模型之一。1996年，歐洲經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）將斑馬魚(yú)胚胎檢測(cè)技術(shù)列為測(cè)定單一化學(xué)物毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，并且制定了詳細(xì)的操作指南［12］。利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物發(fā)育毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，在加藥處理斑馬魚(yú)胚胎后，結(jié)合活體染料、抗體、熒光示蹤等方法，研究者可以直接觀察原腸期的血液循環(huán)、心跳、腦區(qū)形成、體軸形成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等胚胎發(fā)育事件。

4 斑馬魚(yú)模型在神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)的神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)非常敏感［13－15］，其大腦整體構(gòu)造和血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能均與哺乳動(dòng)物相似［16－18］。在胚胎發(fā)育早期，斑馬魚(yú)的血腦屏障即開(kāi)始起作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，許多在人體中具有神經(jīng)毒性的化合物在斑馬魚(yú)身上同樣起作用。例如維甲酸可導(dǎo)致神經(jīng)元氧化和凋亡，酒精可引起視神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)缺陷，新霉素可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡等。Baraba等發(fā)現(xiàn)，驚厥誘導(dǎo)劑——戊四唑會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)痙攣，并且其作用于斑馬魚(yú)后，斑馬魚(yú)的電圖變化、行為變化和分子水平改變均與嚙齒類動(dòng)物痙攣模型相似［7］。

傳統(tǒng)的利用哺乳動(dòng)物來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性的方法包括行為學(xué)分析、神經(jīng)組織病理學(xué)分析和生物化學(xué)分析等，這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力。斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)即可發(fā)育成熟，例如斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至24 hpf時(shí)，原代的神經(jīng)元細(xì)胞就開(kāi)始分化，48 hpf時(shí)腦室形成，隨后到6 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)的整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)形成。所以利用斑馬魚(yú)可以對(duì)藥物的神經(jīng)毒性進(jìn)行快速、有效地評(píng)價(jià)。研究藥物神經(jīng)毒性時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎加藥處理后，利用微分干涉相差顯微鏡或特殊染色方法可以直接在體內(nèi)觀察特定神經(jīng)元和神經(jīng)突的改變［20］。通過(guò)胚胎整體原位雜交、免疫熒光和特羅蘭染色等方法，還可以評(píng)價(jià)藥物對(duì)斑馬魚(yú)髓鞘、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元和視神經(jīng)元等的作用。由于斑馬魚(yú)具有學(xué)習(xí)、睡眠和藥物成癮等神經(jīng)性行為［21－26］，所以可以通過(guò)行為學(xué)分析對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)元的功能進(jìn)行研究。斑馬魚(yú)胚胎或是幼魚(yú)的行為學(xué)分析可以在多孔板中進(jìn)行［27－28］，便于觀察和操作。

5 斑馬魚(yú)模型在器官毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)的各內(nèi)臟器官在基因水平上與人類具有87%的同源性，各個(gè)器官在解剖和分子水平上也已經(jīng)證實(shí)與哺乳動(dòng)物具有一定相似性［23］。盡管斑馬魚(yú)缺少肺循環(huán)，但是比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，斑馬魚(yú)的魚(yú)鰾與哺乳動(dòng)物的肺之間具有同源性。因此斑馬魚(yú)是一種非常理想的藥物器官毒性評(píng)價(jià)模型［29］。

5.1 心臟毒性評(píng)價(jià)

心臟是斑馬魚(yú)第一個(gè)發(fā)育并發(fā)揮重要功能的器官。心肌收縮、心率和外觀形態(tài)等均是心臟功能的重要參數(shù)指標(biāo)。由于斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)透明，因此研究人員均可以在活體斑馬魚(yú)上對(duì)以上各指標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察研究。借助微電極，研究人員還可以同時(shí)記錄斑馬魚(yú)的復(fù)合動(dòng)作電位［30］。統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)心跳頻率時(shí)，可以將活體胚胎或是幼魚(yú)麻醉，然后通過(guò)人工計(jì)數(shù)或是錄像記錄等方法來(lái)進(jìn)行［31－33］。受精后5 d的斑馬魚(yú)胚胎可以通過(guò)非侵入的方式進(jìn)行心電圖檢測(cè)，從而了解其心肌是否缺血，心室是否肥厚［34］。

許多研究已表明，在人體中可影響心臟功能的藥物大多也可對(duì)斑馬魚(yú)心臟造成相似影響［33，35－41］。例如特非那定和氯米帕明等藥物，可以造成人體心律失調(diào)和負(fù)性肌力效應(yīng)，同樣也可以引起斑馬魚(yú)心臟收縮性降低、心跳過(guò)緩、循環(huán)減緩等。心臟QT間期代表了心室除極和復(fù)極全過(guò)程所需的時(shí)間，其長(zhǎng)短與心率的快慢密切相關(guān)。人體QT間期延長(zhǎng)大多數(shù)表現(xiàn)為尖端扭轉(zhuǎn)型心動(dòng)過(guò)速，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)室性心律失常甚至猝死。因此在新藥研發(fā)過(guò)程中，藥品是否會(huì)造成心臟QT間期延長(zhǎng)，是一個(gè)非常關(guān)鍵的問(wèn)題。研究表明，藥物導(dǎo)致的心臟QT間期延長(zhǎng)是由于hERG鉀離子通道阻斷所造成的。在斑馬魚(yú)中也存在著類似的zERG基因［37，41－42］。許多在人體上引起QT間期延長(zhǎng)的藥物均能造成斑馬魚(yú)心律失常和心動(dòng)過(guò)緩。Abbott研究室利用斑馬魚(yú)胚胎作為研究對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，結(jié)果表明，幾乎所有已知的可造成心臟QT間期延長(zhǎng)的藥物，均可以造成斑馬魚(yú)胚胎心室率和心房率不一致［32］。以上研究均表明，斑馬魚(yú)是一種理想的評(píng)價(jià)新藥心臟毒性的模式生物。

5.2 腎臟毒性評(píng)價(jià)

斑馬魚(yú)的腎臟稱為原腎，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由一對(duì)腎單位、兩個(gè)腎小球和前腎小管組成。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至40 hpf時(shí)，其前腎即具備血液濾過(guò)功能［43］，發(fā)育至96 hpf時(shí)，斑馬魚(yú)的腎臟濾過(guò)超微結(jié)構(gòu)亦發(fā)育完全，至此，斑馬魚(yú)的腎臟功能完全成熟。斑馬魚(yú)腎小球由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和極性管狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，這一點(diǎn)與高等脊椎動(dòng)物非常相似［43］。盡管斑馬魚(yú)的前腎結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，但是加藥處理后，其在腎臟損傷的表型方面與哺乳動(dòng)物非常類似，例如對(duì)腎毒性藥物——慶大霉素相當(dāng)敏感。研究表明，發(fā)育到50～54 hpf的斑馬魚(yú)心臟靜脈竇注射慶大霉素后，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的形態(tài)異常和腎臟系統(tǒng)功能異常，具體表現(xiàn)為心包和顱內(nèi)水腫、腎小球?yàn)V過(guò)率降低等［44－45］，這一表型類似于慶大霉素造成的哺乳動(dòng)物腎中毒現(xiàn)象［46］。當(dāng)利用順鉑或是嘌呤霉素等腎毒性藥物處理斑馬魚(yú)幼魚(yú)時(shí)，與高等脊椎動(dòng)物相似，同樣會(huì)造成腎臟損傷［47］。由于斑馬魚(yú)在腎臟損傷方面的表型與人類非常類似，所以以其作為動(dòng)物模型，可以對(duì)藥物的腎臟毒性進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

5.3 肝臟毒性評(píng)價(jià)

肝臟是斑馬魚(yú)最大的腺體，斑馬魚(yú)發(fā)育到48 hpf時(shí)，肝臟形態(tài)基本形成，至72 hpf后，斑馬魚(yú)肝臟的形態(tài)和功能全部發(fā)育完全［48］。在斑馬魚(yú)肝臟中，存在多種與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶，包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA裂解酶和氧化物酶體增殖物激活受體家族的各個(gè)成員等［49］。傳統(tǒng)的肝臟毒性評(píng)價(jià)包括肝臟排泄功能檢測(cè)、組織病理學(xué)檢測(cè)、血清酶檢測(cè)、肝臟細(xì)胞色素P450檢測(cè)、肝臟特異標(biāo)記物表達(dá)檢測(cè)和肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)等。由于斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的防御機(jī)制類似，均為酶的誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激，且作用機(jī)制也類似［50－51］；同時(shí)斑馬魚(yú)中含有94種細(xì)胞色素P基因，其中18種基因與哺乳動(dòng)物同源［52］，所以利用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)待測(cè)藥品肝臟毒性時(shí)，同樣可以使用上述傳統(tǒng)的肝臟毒性檢測(cè)指標(biāo)。研究表明，氨基甲酸酯具有哺乳動(dòng)物肝臟毒性，將該化合物作用于斑馬魚(yú)，其產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與哺乳動(dòng)物類似［48］。2013年，He等［53］利用6種已知的具有哺乳動(dòng)物肝臟毒性和2種不具有肝臟毒性的藥物分別處理斑馬魚(yú)后，檢測(cè)斑馬魚(yú)卵黃囊停滯、肝臟細(xì)胞凋亡和肝臟形態(tài)改變等情況，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)對(duì)藥物肝臟毒性檢測(cè)的準(zhǔn)確率高達(dá)100%。

5.4 胃腸毒性評(píng)價(jià)

斑馬魚(yú)的胃腸系統(tǒng)與人類差異較大，沒(méi)有胃，食道較短，腸道緊隨其后。Ng等［54］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至26～126 hpf后，其腸道的管腔形成，并不斷生長(zhǎng)，內(nèi)胚層分化形成了有功能的腸道上皮。在未喂食時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎的腸道即開(kāi)始游走性蠕動(dòng)。由于斑馬魚(yú)早期體外發(fā)育，全身透明，所以其胃腸蠕動(dòng)均可直接觀察。研究表明，氯丙嗪和異丙腎上腺素等可使斑馬魚(yú)腸腔擴(kuò)增［5］。因此，利用斑馬魚(yú)研究藥物胃腸毒性時(shí)，可通過(guò)直接統(tǒng)計(jì)胃腸蠕動(dòng)次數(shù)來(lái)完成。

5.5 耳毒性評(píng)價(jià)

哺乳動(dòng)物的耳通常由外耳、中耳和內(nèi)耳三部分組成。與此不同，斑馬魚(yú)只具有內(nèi)耳。雖然從解剖學(xué)上看，斑馬魚(yú)的耳與哺乳動(dòng)物具有明顯的不同。但是耳中的聽(tīng)覺(jué)感受器——毛細(xì)胞在斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物中卻具有高度的相似性［57］。聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞是一種聽(tīng)覺(jué)轉(zhuǎn)換器，可以將外界的聲音刺激轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，最終產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。斑馬魚(yú)側(cè)線上的神經(jīng)丘在結(jié)構(gòu)和功能上即相當(dāng)于人類的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞。聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞的發(fā)育受到多種基因的調(diào)控，在斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，這些基因均具有高度的同源性［58］。人類的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，一旦受損，不能再生，而斑馬魚(yú)幼魚(yú)的神經(jīng)丘卻可以再生［59］。

斑馬魚(yú)胚胎時(shí)期，神經(jīng)丘在光鏡下清晰可見(jiàn)。利用DASPEI或是FM1-43活體染色技術(shù)，可以直接觀察斑馬魚(yú)神經(jīng)丘毛細(xì)胞的數(shù)量、完整性及其功能［60－61］，方便研究待測(cè)藥物對(duì)聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞的毒性影響。除此之外，還可以通過(guò)聽(tīng)覺(jué)刺激驚嚇?lè)磻?yīng)來(lái)研究藥物對(duì)斑馬魚(yú)聽(tīng)力的影響。研究表明，發(fā)育至7 dpf的正常斑馬魚(yú)受到聲音刺激時(shí)，其自發(fā)活動(dòng)明顯提高［62］。許多在人類身上具有耳毒性的藥物，例如新霉素、慶大霉素和奎寧等，均可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)神經(jīng)丘的丟失，從而造成其聽(tīng)覺(jué)障礙［60，63－65］。DMSO已被證實(shí)可以加劇順鉑造成的斑馬魚(yú)幼魚(yú)聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞死亡［66］。以上研究均說(shuō)明，斑馬魚(yú)是一種評(píng)價(jià)藥物耳毒性的理想動(dòng)物模型。

5.6 視毒性評(píng)價(jià)

斑馬魚(yú)胚胎期的視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育非常迅速，5 dph的斑馬魚(yú)幼魚(yú)即具有非常成熟的視覺(jué)系統(tǒng)和視覺(jué)介導(dǎo)的行為。同時(shí)，斑馬魚(yú)還具有與人類相似的錐形視網(wǎng)膜和色彩視覺(jué)［67］。因此，可以利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物的視覺(jué)毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究人員通常采用眼動(dòng)反應(yīng)和視動(dòng)反應(yīng)對(duì)斑馬魚(yú)的視覺(jué)功能進(jìn)行分析。眼動(dòng)反應(yīng)和視動(dòng)反應(yīng)均屬于視覺(jué)刺激誘發(fā)性行為，無(wú)需訓(xùn)練即可誘導(dǎo)產(chǎn)生，人類亦具有以上兩種反應(yīng)［68］。因此，可將待測(cè)藥物處理斑馬魚(yú)，然后利用眼動(dòng)反應(yīng)和視動(dòng)反應(yīng)對(duì)斑馬魚(yú)的視覺(jué)功能進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)藥物的視覺(jué)毒性進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。2008年，Richards等［69］以斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)視動(dòng)反應(yīng)，對(duì)27種化合物進(jìn)行了視毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與體內(nèi)、體外及臨床數(shù)據(jù)相比，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性高達(dá)70%。

6 斑馬魚(yú)模型在生殖毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

生殖毒性通常是指藥物對(duì)雄性或是雌性個(gè)體生殖功能的損害，及其對(duì)后代的有害影響。嚙齒類動(dòng)物是一種常用的評(píng)價(jià)生殖毒性的動(dòng)物模型，但是其花費(fèi)昂貴，并且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。與此不同，斑馬魚(yú)發(fā)育較快，受精72 h后即完成孵化，并且孵化后3個(gè)月內(nèi)可達(dá)到性成熟，成年斑馬魚(yú)的繁殖周期一般只有7 d左右，并且雌性斑馬魚(yú)一次產(chǎn)卵可多達(dá)200個(gè)［5］。因此，利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)既經(jīng)濟(jì)又快速。斑馬魚(yú)在早期胚胎和幼魚(yú)的發(fā)育過(guò)程中，原始的性腺均相同，沒(méi)有性別分化并且具有雙向發(fā)育潛能。許多外界因素，例如光照、溫度和pH值等均能影響并改變其遺傳性別［55］。

性腺指數(shù)（GSI）是一個(gè)常用的評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)性腺功能的生物指標(biāo)，主要指斑馬魚(yú)性腺與體重的比。性腺指數(shù)下降表示斑馬魚(yú)的垂體、下丘腦或是性腺活性降低。對(duì)于性成熟的雌性和雄性斑馬魚(yú)而言，產(chǎn)卵量和精子活力及密度分別是評(píng)價(jià)其生殖能力的常用指標(biāo)。研究表明，17β雌二醇和鉛等均能抑制成年雌性斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵量，并且產(chǎn)卵量與17β雌二醇之間具有明顯劑量依賴效應(yīng)。鄰苯二甲酸二丁酯和壬基酚等會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)精子數(shù)量減少、激活率降低、精子壽命及劇烈活動(dòng)時(shí)間縮短［55］。在性成熟的脊椎動(dòng)物血清中，存在一種雌性特有的血清蛋白——卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG），該蛋白的合成受到激素嚴(yán)格控制。卵黃生成期的雌性斑馬魚(yú)可分泌雌激素，進(jìn)而誘導(dǎo)卵黃蛋白原的產(chǎn)生［56］。研究表明，雄性斑馬魚(yú)也存在VTG基因，在雌激素或是類雌激素的誘導(dǎo)下，雄性斑馬魚(yú)也可以合成卵黃蛋白原［55］。將待測(cè)藥品作用于斑馬魚(yú)，然后檢測(cè)雄魚(yú)、幼魚(yú)及非卵黃生成期雌性斑馬魚(yú)體內(nèi)卵黃蛋白原水平的改變，可以作為評(píng)價(jià)藥物生殖毒性的一個(gè)靈敏而可靠的方法。許多藥物除了直接對(duì)親代斑馬魚(yú)的生殖系統(tǒng)造成損傷外，還有可能影響其子代的正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，通常還需對(duì)子代胚胎的孵化率、畸形率等進(jìn)行分析。

7 結(jié)語(yǔ)

利用斑馬魚(yú)模型對(duì)新藥進(jìn)行早期安全性評(píng)價(jià)，其明顯優(yōu)勢(shì)是可以提高藥物早期毒性預(yù)測(cè)的可靠性和靈敏度，縮短新藥研發(fā)周期，降低新藥研發(fā)成本，提高新藥研發(fā)的成功率。但該模型也存在著一些不足，由于給藥方式主要是將藥物溶解于培養(yǎng)水中，藥物通過(guò)滲透的方式進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)，因此藥物的理化性質(zhì)尤其是在水中的溶解性與分子量對(duì)結(jié)果影響較大，存在著假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象，一些脂溶性強(qiáng)和分子量大的藥物目前尚不適合采用該模型進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，結(jié)合納米技術(shù)、脂質(zhì)體技術(shù)等醫(yī)藥新技術(shù)，斑馬魚(yú)在藥物早期安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用技術(shù)也將進(jìn)一步完善、成熟和規(guī)范。作為21世紀(jì)藥物早期安全性快速評(píng)價(jià)的新模型，斑馬魚(yú)必將憑借自身優(yōu)勢(shì)，在新藥研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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Application of zebrafish model in early drug safety assessment

LIU Ke-chun，SUN Chen，WANG Xi-min，HOU Hai-rong
（Biology Institute，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

The construc tion of economical and effec tive early drug safety assessment technology has become g lobal urgent requirement in drug research anddevelopment area．Zeb rafish，one of three common model animals，is an ideal drug early safety assessmentmodel．New drug safety assessmentw ith the model can imp rove reliability andsensitivity of early drug toxicity prediction，reduce new drug research anddevelopment periodandcost，andimp rove success rate of drug research anddevelopment．We survey the app lication of zebrafish model in early drug safety assessment，such as general toxicity assessment，g row th toxicity assessment，neurotoxicity assessment，organ toxicity assessment，andrep roductive toxicity assessment，etc．With the development of biological and medicine technology，zeb rafish will play a more important role in early drug safety assessment area，and promote drug research and development process．

zeb rafish；early drug safety assessment；toxicity evaluation

R965.3

A

1002-4026（2014）05-0001-08

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.001

2014-08-21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31400979）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2001GHY11505；2013GHY11516）

劉可春（1964－），男，博士，研究員，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。Email：hliukch＠sdas.org