脊椎動(dòng)物防御素的研究進(jìn)展

段婷婷，李丕鵬，陸宇燕

（1.沈陽師范大學(xué) 兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué) 遼寧省生物進(jìn)化與生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110034）

防御素（defensin）是免疫系統(tǒng)中重要的防御性蛋白質(zhì)，由于其廣譜抗微生物的特點(diǎn)，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，在早期抑制、抵御和殺滅多種外來病原微生物等方面發(fā)揮著不可取代的作用。脊椎動(dòng)物的防御素依據(jù)半胱氨酸的分布和二硫鍵連接方式的不同，分為α－防御素、β－防御素和θ－防御素3種。主要分布于哺乳類的中性粒細(xì)胞以及人類和嚙齒動(dòng)物小腸潘氏細(xì)胞中的α－防御素，是1966年Zeya等在兔子和豚鼠中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，起初稱為“陽離子抗菌蛋白”，后來被命名為α－防御素［1－2］；β－防御素是Diamond［3］等1991年從牛氣管粘膜上皮分離得到的，后證實(shí)在脊椎動(dòng)物呼吸道、消化道及泌尿生殖道粘膜層有大量表達(dá)，是這些器官的粘膜免疫的重要組成成分，構(gòu)成其先天免疫屏障；θ－防御素是Tang［4］等1999年從獼猴白細(xì)胞中分離得到的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的防御素，該防御素僅在除人以外的靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)。由此可見，防御素中的β－防御素分布區(qū)域最廣，且均表達(dá)于機(jī)體與外界環(huán)境直接和間接相接觸的位置，參與構(gòu)成了機(jī)體抵御外界微生物侵襲的免疫屏障。本文就脊椎動(dòng)物β－防御素的結(jié)構(gòu)與功能作一總結(jié)，為相關(guān)研究人員提供便利。

1 β－防御素的蛋白結(jié)構(gòu)

在β－防御素的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，氨基酸的排列順序和組成的多樣性始終是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。不同物種氨基酸數(shù)量不同：人β－防御素氨基酸數(shù)量為36～65，小鼠為38～42，綿羊?yàn)?5～50，魚類為39～45［5－7］，它們的共同特點(diǎn)是具有8個(gè)高度保守的氨基酸殘基：第1類是C末端的6個(gè)間隔不等的半胱氨酸（Cys）殘基，可形成最多3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，連接方式均為Cys1～Cys5，Cys2～Cys4，Cys3～Cys6。第2類是位于N末端的2個(gè)甘氨酸殘基（Gly），第1個(gè)Gly位于N端第2個(gè)Cys上游相隔一個(gè)氨基酸殘基的位置，第2個(gè)Gly位于第4個(gè)Cys間隔一個(gè)氨基酸殘基位置處。而且，由于帶正電荷的氨基酸殘基大多聚集在C末端，形成了一個(gè)正電荷富集的區(qū)域，而此區(qū)域的凈電荷數(shù)是防御素實(shí)現(xiàn)抗菌功能的必備條件［8］。借助2～3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，β－防御素形成了一個(gè)整體呈“U”形空間結(jié)構(gòu)，分子的頂部為C末端和N末端氨基酸殘基組成的極性部分，而底部則為非極性部分。分子中主要包含3個(gè)反向平行的β－折疊片層結(jié)構(gòu)、其N末端具有形成趨勢(shì)的α－螺旋結(jié)構(gòu)以及兩種結(jié)構(gòu)之間的Loop區(qū)［9］，且由Cys1～Cys5相連α－螺旋與第3條β－折疊片層，由Cys2～Cys4相連β－折疊片層1和2，由Cys3～Cys6相連β－折疊片層1和2間形成的Loop區(qū)與第3條β－折疊片層。α－螺旋和β－折疊結(jié)構(gòu)均為雙親媒性，對(duì)防御素與微生物細(xì)胞膜相互作用具有很好的促進(jìn)作用。另外，防御素單體還可以通過分子間非共價(jià)交聯(lián)的鹽橋形成二聚體，也可以通過未參與分子內(nèi)二硫鍵的Cys殘基以分子間二硫鍵的方式形成二聚體。二聚體的形成使疏水氨基酸殘基進(jìn)一步聚集，增加了分子表面電荷量，使β－防御素的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，且抗菌活性也得到了提升。

2 β－防御素的表達(dá)調(diào)控

人β－防御素1（HBD－1）和豬β－防御素1（PBD－1）及PBD－3在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)量基本保持穩(wěn)定，不受炎性因子的誘導(dǎo)，故稱為固有型表達(dá)。而大多數(shù)β－防御素可在放線菌、細(xì)菌、IL－lβ、TNF－α、真菌、病毒、脂多糖等物質(zhì)刺激下，由病原菌及其產(chǎn)物與細(xì)胞中病原識(shí)別受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可誘導(dǎo)防御素mRNA成倍的表達(dá)，故稱之為誘導(dǎo)型的表達(dá)方式，HBD－2、HBD－3和PBD－2以及MBD－2、MBD－3、MBD－6屬于此種類型的防御素。機(jī)體內(nèi)β－防御素兩種表達(dá)方式的結(jié)合，形成了固有型表達(dá)的防御素提供基礎(chǔ)性防御作用，對(duì)病原菌的侵入進(jìn)行快速反應(yīng)和初步殺滅，誘導(dǎo)型表達(dá)的防御素進(jìn)一步徹底清除病原微生物的互補(bǔ)的防御模式。而不同表達(dá)方式的β－防御素最根本的區(qū)別在于誘導(dǎo)型的防御素基因序列中含有NF－ΚB和AP－1的作用元件，需要炎性因子刺激后才能被誘導(dǎo)表達(dá)［5］。

關(guān)于β－防御素誘導(dǎo)的表達(dá)，研究的較為透徹的是NF－ΚB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［10－11］：當(dāng)致病微生物侵入機(jī)體時(shí)，機(jī)體相應(yīng)部位細(xì)胞表面的病原模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）如Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）可以用其胞外區(qū)的亮氨酸重復(fù)序列識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogenassiciated molecular patterns，PAMPs）成分后，經(jīng)胞內(nèi)區(qū)Toll－IL－1受體結(jié)構(gòu)域與骨髓分化初反應(yīng)蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）結(jié)合后，再與接頭分子MAL結(jié)合并激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激酶1（TGF－βactivated kinase 1，TAK1），進(jìn)而激活NF－ΚB誘導(dǎo)酶（NIK），再由NIK將IKKα／β進(jìn)行磷酸化。激活后的IKKα／β可促使I－ΚB磷酸化，釋放出原來與其結(jié)合的NF－ΚB的兩個(gè)亞基p50和p65，NF－ΚB入核后與誘導(dǎo)型防御素基因序列中的作用元件相結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。另外研究表明，當(dāng)以CpG ODN（合成含CpG核苷酸對(duì)基序的寡核苷酸）作用于體外培養(yǎng)的肺腺上皮細(xì)胞A549，可以通過TLR9途徑激活p38MAPK信號(hào)分子，進(jìn)而激活NF－ΚB，使其釋放p50和p65進(jìn)入細(xì)胞核，指導(dǎo)HBD－2基因表達(dá)［12］；在人中耳上皮細(xì)胞株中，流感嗜血桿菌通過TLR2－MYD88－IRAK－IRA6－p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控HBD－2表達(dá)［13］。這兩條信號(hào)通路共同的途徑是TLRs－MyD88部分。

3 β－防御素的生物活性

3.1 抗微生物活性

β－防御素具直接有殺滅細(xì)菌的功能，雖然對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有殺傷作用，但實(shí)驗(yàn)顯示10μg／mL濃度的HBD－2對(duì)屬于G－的大腸桿菌和綠膿桿菌的殺傷率可達(dá)到90%，而對(duì)屬于G＋的金黃色葡萄球菌的殺傷率僅為9%［5，14－15］。這是由于兩種細(xì)菌細(xì)胞膜成分的差異而導(dǎo)致的，帶有陽離子精氨酸側(cè)鏈的β－防御素易于通過靜電作用與G－易于結(jié)合，而與G＋結(jié)合能力較弱，需要借助G＋細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷壁酸才能與β－防御素結(jié)合［9，27－28］。因此，β－防御素對(duì) G－的作用效果強(qiáng)于 G＋的作用效果。

用HBD－3處理非洲爪蟾卵母細(xì)胞后［16］，以二極電壓鉗記錄細(xì)胞膜兩側(cè)離子電流的感應(yīng)現(xiàn)象，并進(jìn)行Detailed tail current分析，結(jié)果顯示在膜兩側(cè)均可檢測(cè)到KCl、NaCl、CaCl2等鹽離子的存在，提示卵母細(xì)胞質(zhì)膜的半透性遭損壞，導(dǎo)致了膜內(nèi)外物質(zhì)的相互流動(dòng)。利用掃描電鏡觀察rHBD－3對(duì)早期和成熟期銅綠假單胞菌細(xì)菌生物膜（BF）的作用，發(fā)現(xiàn)用2倍最低抑菌濃度（MIC）的防御素處理銅綠假

3.2防御素與炎癥反應(yīng)

誘導(dǎo)型的β－防御素不僅可以由致病微生物表面物質(zhì)的誘導(dǎo)而表達(dá)，還可以由炎性因子刺激進(jìn)一步提高表達(dá)量。以惡唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠研究中發(fā)現(xiàn)［20］，其上皮細(xì)胞MBD－2的mRNA的表達(dá)量明顯高于正常組，且兩者之間呈極顯著性差異；武慶平［21］發(fā)現(xiàn)模擬呼吸機(jī)的機(jī)械通氣大鼠肺部感染銅綠假單胞菌（PA）后肺組織RBD－2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均呈先上升后下降的現(xiàn)象。另外，DEFB126（Humanβ－defensin 126）能引起體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的促炎性因子IL－α，IL－1β，IL－6和TNF－αmRNA表達(dá)量下調(diào)［22］；而在細(xì)菌感染的大鼠體內(nèi)，在RBD－2水平升高的同時(shí)，其肺組織中IL－1α、IL－1β等炎性因子含量有不同程度的下降，而抗炎因子IL－4、IL－10則明顯升高［23］。提示β－防御素具有抑制促炎性因子和促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用［24］。研究顯示在炎癥發(fā)生早期，促炎性細(xì)胞因子可以通過Src依賴的Raf－MEK1／2－ERK1／2－MAPK信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)β－防御素表達(dá)上調(diào)，以參與炎癥反應(yīng)中對(duì)病原體的直接殺滅。當(dāng)大量防御素存在的情況下，憑借其免疫激活功能可誘導(dǎo)未分化的T輔助淋巴細(xì)胞（Th0）向Th2類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，而減少向Th1類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致Th1類型細(xì)胞分泌的促炎性因子減少，Th2類型細(xì)胞分泌的抗炎性因子增多［23］。臨床發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病患者皮損部位皮膚極少感染，但其HBD－2mRNA表達(dá)水平明顯高于正常人皮膚的表達(dá)量［25］，從另一方面說明了防御素對(duì)促炎性因子的抑制作用。促炎性細(xì)胞因子的被抑制緩解了機(jī)體的炎性反應(yīng)，同時(shí)其對(duì)防御素的誘導(dǎo)作用也將同步降低。隨著防御素在組織間的擴(kuò)散，當(dāng)其濃度降至納克水平后，防御素就喪失了殺菌活性，而其另一特殊功化活性得以發(fā)揮，通過募集白細(xì)胞進(jìn)一步清除感染部位的病原體。單胞菌作用24h后BF結(jié)構(gòu)變得稀疏、不規(guī)則，交聯(lián)多糖復(fù)合物減少，BF內(nèi)細(xì)菌存活率降低。4倍MIC組BF結(jié)構(gòu)損傷程度更加明顯，并且rHBD－3對(duì)BF形成和其內(nèi)活菌數(shù)量均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用［17］。用MIC的PBD－1和PBD－2分別作用于枯草芽孢桿菌ATCC 6633和銅綠假單胞菌CMCC 10104 1h后，透射電鏡觀察顯示：菌體細(xì)胞膜斷裂，核區(qū)溶解，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，菌體空泡化［18］。因此，目前對(duì)β－防御素的抗菌機(jī)制普遍認(rèn)為是：β－防御素與細(xì)菌細(xì)胞膜接觸后，將其疏水部分的短肽插入靶細(xì)胞膜中，進(jìn)而依靠細(xì)胞膜的電動(dòng)勢(shì)拉動(dòng)整個(gè)分子進(jìn)入質(zhì)膜，形成跨膜的離子通道，改變膜的完整性和通透性，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓發(fā)生變化，最終細(xì)菌不能維持自身正常的生命活動(dòng)而不可逆死亡。

有研究指出二硫鍵對(duì)昆蟲防御素（Lee KH 1998；Fázio MA 2006）抗菌功能來說是必須的因素，但對(duì)牛β－防御素2（BNBD－2）和BNBD－12的研究表明，二硫鍵連鍵模式的不同所帶來的結(jié)構(gòu)上的差異并沒有對(duì)其活性造成影響；突變后的HBD－1分子內(nèi)僅有2個(gè)二硫鍵，但其抗菌活性卻與天然HBD－1相近；將HBD－3的3個(gè)二硫鍵連接方式1－5，2－4和3－6改為1－6，2－5和3－4，其抗菌活性與二硫鍵正常連接的HBD－3相近。因此可以認(rèn)為二硫鍵的存在和分布狀態(tài)對(duì)哺乳類β－防御素抗菌活性的影響微乎其微。

β－防御素的抗菌能力還與其自身所帶正電荷數(shù)有關(guān)。HBD－1、HBD－2和HBD－3凈電荷數(shù)分別為＋4、＋6和＋11，其中抗菌活性最強(qiáng)的是HBD－3［15］。而研究顯示，HBD－3不僅單位長(zhǎng)度下正電荷聚集程度較高，而且還擁有較長(zhǎng)的α－螺旋片段，二者均具有促進(jìn)與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合的作用［8，19］。故使得HBD－3具有較其他β－防御素更強(qiáng)的抗菌活性。

防御素的抗菌活性還受到環(huán)境中離子種類和濃度等因素的影響。HBD－3在50mol／L NaCl溶液中對(duì)大腸桿菌的殺菌活性可達(dá)90%左右，而在100mol／L NaCl下的殺菌活性還不到50%［19］。二價(jià)陽離子如Ca2＋、Mg2＋等能夠顯著抑制防御素活性，而一價(jià)陰離子如Cl－等對(duì)其活性影響不大。推測(cè)高濃度鹽溶液中較多的正電荷和同樣帶正電荷的防御素存在著爭(zhēng)奪與帶有負(fù)電荷的細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致了β－防御素與細(xì)菌胞膜的結(jié)合力變?nèi)?，抗菌活性降低?/p>

3.3 趨化活性與免疫激活

防御素通過選擇性的趨化作用，可趨使天然免疫系統(tǒng)中的白細(xì)胞向炎癥部位集中，通過吞噬作用消滅病原微生物。HBD－1可趨化單核細(xì)胞，HBD－3和4可趨化巨噬細(xì)胞，HBD－2可趨化肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，HBD－2通過與肥大細(xì)胞表面的G蛋白－磷酸酯酶C信號(hào)途徑作用，完成對(duì)肥大細(xì)胞的趨化和激活作用。而HBD－2對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用不僅有G蛋白－磷酸酯酶C信號(hào)途徑的參與，更重要的是由趨化因子受體CCR6作為其主要的功能受體。另外，肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)物中的TNF－α作為促炎性因子也能增加嗜中性粒細(xì)胞聚集。

作為趨化因子的吞噬細(xì)胞炎癥蛋白3（CCL20／MIP3α）是CCR6的唯一配體［5］，研究發(fā)現(xiàn)CCL20／MIP3α的Asp5～Asp8結(jié)構(gòu)，提示了與HBD－2的Asp4～Leu9結(jié)構(gòu)類似，而此結(jié)構(gòu)正好是CCL20／MIP3α與CCR6特異性結(jié)合的位點(diǎn)β－防御素發(fā)揮趨化作用的依據(jù)［15］。而轉(zhuǎn)染了CCR6的HEK細(xì)胞可以被HBD－3、MBD－2和MBD－3所趨化也為上述結(jié)論提供了佐證。對(duì)于不具有CCR6分子的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來說，β－防御素也可以通過含有多個(gè)趨化因子結(jié)合位點(diǎn)的CCR2分子來行使其趨化作用［26］。

抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）是機(jī)體免疫應(yīng)答中的首要環(huán)節(jié)，而樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞3種APC中DC的功能是最強(qiáng)的，其能夠刺激處女型和初始型T細(xì)胞增殖，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。防御素以其富集正電荷的C端作用于病原微生物致使其崩解后，與菌體碎片相連接組成“防御素－菌體碎片”復(fù)合體，隨后以其N端的類似于CCL20／MIP3α的結(jié)構(gòu)與樹突狀細(xì)胞上的CCR6分子結(jié)合［2］，促使iDC轉(zhuǎn)化為mDC，并遷移至淋巴器官后激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答［27］，啟動(dòng)機(jī)體抗微生物感染的獲得性免疫。由于CCR6是介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的信號(hào)分子，因此這也使β－防御素成為連接先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁［2，26］。楊玉榮［28］等檢測(cè)了雛雞口服禽類β－防御素13（Avian beta－defensin 13，AvBD－13）后血清中IgG和IgM水平變化結(jié)果顯示，AvBD－13顯著提高了4～10日齡雛雞血清內(nèi)IgG和10～17日齡雛雞血清內(nèi)IgM含量，發(fā)現(xiàn)口服AvBD－13可以提高禽類的體液免疫，并且能夠明顯促進(jìn)體液免疫系統(tǒng)反應(yīng)，這也證實(shí)了防御素對(duì)獲得性免疫的促進(jìn)作用。

二硫鍵的連鍵模式對(duì)β－防御素趨化作用有重要意義。HBD－3的幾種合成型二硫鍵異構(gòu)體對(duì)含CCR6的HEK293細(xì)胞趨化作用的研究發(fā)現(xiàn)，線性類似物對(duì)兩種細(xì)胞完全沒有趨化活性，而其他異構(gòu)體的趨化活性隨細(xì)胞類型的不同而不同，含有天然二硫鍵的HBD－3對(duì)CCR6／HEK293細(xì)胞的趨化活性最強(qiáng)。此研究提示，β－防御素的趨化活性需要特定的空間構(gòu)象，即能與受體結(jié)合并激活受體的空間構(gòu)象。

4 展 望

細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性是當(dāng)今全球性難題，許多抗生素具有毒副作用，因此，發(fā)展新的動(dòng)物抗感染戰(zhàn)略勢(shì)在必行。防御素由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，勢(shì)必成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕乃幬铮拇嬖谝呀?jīng)得到了各類專家學(xué)者們的極大關(guān)注，在動(dòng)物保健和醫(yī)學(xué)治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著對(duì)防御素的深入研究，將為防御素的抗病原菌感染機(jī)制、炎性反應(yīng)和免疫機(jī)制等方面提供越來越豐富的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有利于開發(fā)研究出更加有效的新型疫苗和相關(guān)的藥物制劑，必要時(shí)可以通過基因工程等方法進(jìn)行大量生產(chǎn)，從而提升機(jī)體其抗病原菌的免疫性。目前對(duì)于防御素的研究仍存在一些未解決的問題，例如一些細(xì)菌病原體已經(jīng)進(jìn)化出抵抗機(jī)制來限制防御素殺傷作用，大部分實(shí)驗(yàn)還停留于動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)，臨床及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少，但是隨著科學(xué)技術(shù)手段的不斷發(fā)展發(fā)展，研究一定會(huì)取得進(jìn)一步突破，這對(duì)新藥研發(fā)技術(shù)思路的現(xiàn)實(shí)意義不言而喻。

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