黃瑞香提取物對小麥病原真菌抑制作用的研究

蘭金榮，葉文斌

（隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500）

黃瑞香（Daphne giraldii nitsche）為瑞香科植物，主要分布于陜西、甘肅、四川、青海，生于海拔1 600 m山地。莖皮及根皮入藥，能止痛、散血、補血，其莖皮和根皮為祖師麻藥材的來源之一，祖師麻辛、苦、溫，有小毒，歸肝經(jīng)。黃瑞香還可以作為純中藥制劑注射液，臨床上用于消炎鎮(zhèn)痛療效顯著，對風濕和類風濕性疼痛療效很好，對癌癥晚期的止痛效果亦較滿意，而且黃瑞香注射液與甲氨喋呤有同等療效[1]。其主要含有香豆素類、二萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、蒽醌類等成分[2]。其中瑞香素（祖師麻甲素）為其指標成分之一[3-4]，由其開發(fā)的制劑有祖師麻片、祖師麻注射液、黃瑞香注射液、祖師麻膏藥、祖師麻關(guān)節(jié)止痛膏等，臨床和制劑使用量很大，但由于其藥用部位為皮部，采收主要以毀滅性的方式進行，不但對主產(chǎn)地植被造成嚴重破壞，而且對其種質(zhì)資源的保護也受到了嚴重的威脅。為節(jié)約藥用植物材料，減少資源浪費，開發(fā)所含其它活性成分。目前，關(guān)于黃瑞香提取物對植物病原菌抑菌活性的研究還未見報道。本試驗利用黃瑞香提取物對小麥病原菌進行深入研究，以研發(fā)出新型的抗植物病原菌制劑，為豐富植物源的生防制劑品種、合開發(fā)利用小麥病害防治以及植物源農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瑞香采自甘肅省隴南市成縣。供試植物病原菌為小麥赤霉病病原菌(Fusarium graminearumSchw.)、小麥根腐病原菌(Helminthosporium sorokinanumSacc.)、小麥紋枯病原菌(Rhizoctonia cerealisVander Hoeven)，這3種病原菌均購自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，病原菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 黃瑞香提取物制備 將黃瑞香全株洗去表面雜質(zhì)，剪成1 cm的小段自然陰干后，以不同溶劑、不同提取時間、不同提取溫度、不同料液比、不同溶劑濃度，水浴回流提取3次，之后用循環(huán)式真空泵進行抽濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得膏狀物，50℃真空干燥，研磨即得到提取物粉末，保存于4℃的冰箱中待用。

1.2.2 病原菌活化

保存的菌種接種與PDA斜面，25℃恒溫培養(yǎng)，然后接種到含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，第7天進行抑菌實驗。

1.2.3 提取物抑菌活性測定 取黃瑞香提取物粉末用水配成25 mg/mL供試液。取配制的供試液0.5 mL于滅菌的10 mL試管中，加入9.5 mL 50℃左右的PDA培養(yǎng)基，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中后，選取長勢整齊的菌落圈，以打孔器制得菌餅，并挖出孔內(nèi)培養(yǎng)基，倒置于上述加藥培養(yǎng)基的平皿上，每皿3個。28℃恒溫倒置培養(yǎng)43 h。用十字交叉法量取菌落圈直徑，取其平均值作為試驗結(jié)果，計算抑制率[5-6]。同時以蒸餾水為對照（CK）。

抑制率＝對照菌落直徑－處理菌落直徑對照菌落直徑×100%。

參考美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)的推薦標準，以抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥，測定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

1.2.4 最低抑菌濃度的確定 采用2倍稀釋法[5-6]，以1%Tween-80為溶劑，取20 mg/mL黃瑞香提取物供試液，配制成1、1/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256等不同稀釋度的溶液，取各個濃度藥液1 mL分別加入到無菌培養(yǎng)皿中，再加入經(jīng)滅菌處理并冷卻至50℃左右的9 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌用PDA培養(yǎng)基)，充分混勻后冷卻制成含樣液平板，接種培養(yǎng)，觀察結(jié)果，與對照組（CK）(菌落正常生長)比較，肉眼可見菌落生長者為無抑制作用，以完全沒有菌落生長的最小質(zhì)量濃度為其MIC[7-9]，以1%Tween-80為溶液作對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，用單因素方差結(jié)合SSR多重比較分析檢驗顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對小麥病原菌抑菌活性比較

稱取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的水、75%甲醇和75%乙醇，50℃水浴回流提取1 h，提取3次，測定不同提取溶劑對小麥病原菌菌絲生長的抑制作用。從表1可以看出，在黃瑞香提取物供試質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，對3種供試小麥病原菌，抑制菌絲效果最佳的均為75%乙醇提取液，且小麥赤霉病病原菌和小麥紋枯病原菌抑制率均達到40%以上。

表1 不同提取溶劑對3種小麥病原真菌菌絲生長的抑制作用比較 %

2.2 不同提取時間對小麥病原菌抑菌活性比較

稱取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的75%乙醇溶液，50℃水浴回流分別提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取3次，測定不同提取時間對3種供試小麥根腐病原菌菌絲生長的抑制作用。從表2可以看出，在提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，不同提取時間對小麥紋枯病原菌原菌和小麥根腐病原菌菌絲的抑制作用影響較大；但是對小麥赤霉病菌原菌抑制效果相對較差。但提取0.5 h時，對小麥3種病原菌菌絲的抑制效果都相對較差，1 h以上抑制效果較好，且二者之間差異顯著。

表2 不同提取時間對3種小麥病原真菌菌絲生長的抑制作用比較 %

2.3 不同提取溫度對小麥病原菌抑菌活性比較

稱取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的75%乙醇溶液，以40、50、60、70和80℃的不同溫度水浴回流提取1 h，提取3次，測定不同提取溫度對3種供試小麥根腐病原菌菌絲生長的抑制作用。從表3可以看出，在提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，提取溫度對小麥紋枯病原菌、小麥根腐病原菌和小麥赤霉病菌菌絲的抑制作用影響明顯，抑制率均達到50%以上；對小麥赤霉病菌病原菌，提取溫度60℃以下的提取物抑菌效果相對較差，提取溫度在70℃以上的提取物抑菌效果較好，而小麥紋枯病原菌和小麥根腐病原菌在80℃提取物抑菌效果較好。結(jié)果表明，75%乙醇和甲醇提取物的抑菌效果較好，水提取物的抑菌效果最差，這說明黃瑞香中主要抑菌活性成分是醇溶性物質(zhì)。通過不同溶劑、不同提取時間、不同提取溫度提取物對植物病原菌的抑菌效果比較，確定了黃瑞香抑菌活性物質(zhì)的提取條件，75%乙醇、70℃以上提取，溫度和提取1 h以上效果較佳，可得到的總體抑菌效果較好的黃瑞香提取物。

表3 不同提取溫度對3種小麥病原真菌菌絲生長的抑制作用比較 %

2.4 最佳提取條件下黃瑞香提取物對小麥病原菌抑菌活性比較

抑菌實驗結(jié)果如表4所示，在75%乙醇、70℃以上提取溫度和提取1 h以上的條件下，可得到總體抑菌效果較好的黃瑞香提取物對小麥紋枯病原菌和小麥赤霉病菌原菌的抑制作用均表現(xiàn)為極敏，對小麥根腐病原菌表現(xiàn)為中敏。

表4 黃瑞香干燥葉片揮發(fā)油抑菌效果

2.5 最佳提取條件下黃瑞香提取物對供試菌的MIC

據(jù)表5實驗結(jié)果選擇研究最佳條件下所得的黃瑞香提取物對供試菌的MIC，采用2倍稀釋法進行測定。由表5可知，黃瑞香提取物對不同供試菌具有不同的抑菌效果，對小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC為1/256；對小麥根腐病原菌MIC均為1/128。

表5 黃瑞香干燥葉片水蒸汽蒸餾揮發(fā)油的MIC

2.6 溫度對黃瑞香提取物抑菌效果的影響

最佳條件下所得的黃瑞香提取物經(jīng)80、100、120和150℃處理15 min后，對各供試菌的抑菌效果見表6?？梢钥闯觯?jīng)過不同溫度加熱處理，提取物對3種供試細菌抑菌效果的影響不大，各處理溫度之間抑菌圈的差異不明顯。因此，可以說明黃瑞香在提取溶劑75%乙醇、提取溫度70℃和提取時間為1 h以上所得提取物的抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性。

表6 黃瑞香提取物不同溫度加熱處理后對各種供試菌的抑菌效果

3 結(jié)論

黃瑞香在提取溶劑75%乙醇、提取溫度70℃和提取時間為1 h以上所得提取物的抑菌活性較好。對小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病菌原菌的抑制作用均表現(xiàn)為極敏，對小麥根腐病原菌表現(xiàn)為中敏。所得提取物對小麥病原真菌的MIC有差異，其中對小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC為1/256；對小麥根腐病原菌MIC均為1/128。而且具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)80、100、120和150℃處理15 min后，其抑菌活性無明顯變化。雖然最佳提取工藝所得提取物對小麥病原真菌具有較好的抑菌效果，但具體的提取優(yōu)化工藝還有待進一步優(yōu)化。黃瑞香中起抑菌效果的具體化學(xué)成分以及黃瑞香中的抑菌成分是某種成分單獨起作用還是幾種同時起協(xié)同作用都有待進一步研究。若能從黃瑞香中提取抑菌活性成分作為生物農(nóng)藥，并且將其直接用于農(nóng)業(yè)植物病害的防治，將會極大地提高黃瑞香的有效利用率，并可減輕環(huán)境壓力，為農(nóng)藥安全生產(chǎn)提供更優(yōu)的選擇，所以研究結(jié)果為進一步開發(fā)利用黃瑞香全株提供實驗依據(jù)。

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