外源NO在低溫脅迫下對茶樹幼苗葉片相對電導率的影響

摘 要：以-4℃模擬低溫脅迫，研究了不同濃度的外源一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP）在低溫脅迫下對湖南地區(qū)大面積種植的4個茶樹品種葉片相對電導率的動態(tài)變化及其相對下降量的影響。結果表明，外源NO可不同程度地降低低溫脅迫下四個茶樹品種葉片的相對電導率，且以0.2 mmol/L的SNP處理效果最好，但不同品種以及低溫脅迫處理時間的長短對外源NO的響應有差異；0.2 mmol/L SNP處理在低溫脅迫24 h時對碧香早和湘妃翠的相對電導率相對下降量分別達7.37%和8.68%，在低溫脅迫48 h時對白毫早和湘波綠的相對電導率相對下降量分別達7.23%和5.88%。

關鍵詞：外源NO；低溫脅迫；相對電導率；茶樹；湖南

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2014）17-0007-03

Effect of Exogenous Nitric Oxide on Relative Conductivity in Tea Seedlings Leaves under Low Temperature Stress

WANG Ying-zi1，2，HUANG Jian-an1，2，LIU Zhong-hua1，2，LI juan1，3，LI yin-hua1，3，LI shi1，3，TIAN Chang4

（1. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals， Changsha 410128， PRC；2. Ministry of Education’s Key Lab of Tea Science， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC；3.College of Horticulture and Gardening， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， PRC；4.College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract：The effects of sodium nitroppmsside（SNP）as an exogenous nitric oxide donor at the -4 ℃ low temperature stress conditions on the dynamic changes of conductivity and relative decline in the amount of content in tea leaves under low temperature stress were studied.The results showed that exogenous NO can reduce the relative conductivity of tea leaves under low temperature stress，and to deal with the effect of SNP concentration in 0.2mmol/L for the best，but there are differences in the effects of different varieties and times ，0.2mmol/LSNP treatment under low temperature stress 24h declines relative conductivity values in Bixiangzao and Xiangfeicui by 7.37% and 8.68%，Baihaozao and Xiangbolv decline in the value of relative conductivity at 48h by 7.23% and 5.88% respectively.

Key words：exogenous nitric oxide； low temperature stress； relative conductance； tea plant； Hunan

收稿日期：2014-08-03

基金項目：湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學開放課題基金項目（2013YYX010）

作者簡介：王英姿（1986-），女，湖南長沙市人，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種方面的研究。

通訊作者：黃建安，田 昌

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，喜溫喜濕耐陰但對低溫較為敏感。低溫是茶樹栽培過程中常見的一種自然災害，不僅嚴重損害茶樹生長引起大幅減產(chǎn)，甚至可以導致茶樹死亡[1]，低溫環(huán)境下，細胞原生質流動減慢或停止，水分平衡失調，光合速率減弱，呼吸速率大起大落。因此，研究茶樹的抗寒機制、篩選優(yōu)良的茶樹抗寒基因、提高茶樹抵御低溫災害的能力，已經(jīng)成為茶葉科學領域重要的研究課題之一[2-3]。

NO作為一種在植物體內普遍存在的關鍵信號分子，能夠調節(jié)植物的生長發(fā)育，并參與植物體內多種非生物脅迫反應的信息傳遞[4]。一般認為，在黃瓜、枇杷、番茄、香蕉等植物體內，NO是通過降低葉片質膜透性，提高葉片葉綠素和可溶性蛋白質的含量及相對含水量，從而抑制過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的積累，增強幼苗體內過氧化物酶活性和抗氧化系統(tǒng)活性，進而提高植株的抗低溫能力以及冷脅迫后的恢復能力[5-9]。而研究表明，茶樹中的NO參與了低溫抑制茶樹花粉萌發(fā)和花粉管伸長的生理過程[10]，促進茶籽萌發(fā)、根部生長，并可以修復脫水干燥過程中造成的活性氧傷害，促進茶籽萌發(fā)過程中的脂代謝，提高游離氨基酸含量和茶氨酸的積累。但關于NO提高茶樹抗寒能力的研究目前報道得還較少。前期的試驗結果表明，0.2 mmol/L硝普鈉（SNP）處理可緩解茶樹低溫脅迫。因此，試驗以湖南地區(qū)大面積種植的4個茶樹品種（碧香早、湘妃翠、湘波綠和白毫早）為材料，在-4℃的低溫脅迫下研究外源噴施不同濃度的SNP（0、0.2和0.5 mmol/L）對茶樹葉片相對電導率及其相對下降量的影響，旨在初步了解外源NO緩解茶樹低溫脅迫的作用效果，為進一步研究外源NO提高茶樹幼苗抗寒的生理機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為碧香早、湘妃翠、湘波綠和白毫早的三年生枝條。主要試劑有外源NO供體硝普鈉

[Na2Fe（CN）5NO·2H2O，簡稱SNP，生工生物有限公司]，用蒸餾水配成100 mmol/L的母液后4℃保存，用時按所需濃度（0、0.2和0.5 mmol/L）稀釋。

1.2 試驗設計

試驗于2014年2～4月進行，選取長勢一致，無病蟲葉的三年生茶樹枝條水培，常溫培養(yǎng)條件控制溫度20±1℃，光照周期為12 h/d，培養(yǎng)3 d；于第4天向茶樹葉片定量噴施外源SNP。試驗設3個處理，分別噴施清水（對照）、0.2 mmol/L SNP、0.5 mmol/L SNP。噴完后將盆缽移至-4℃的人工氣候培養(yǎng)箱進行低溫培養(yǎng)，分別于0、8、24、48 h時采取茶樹枝條芽下第2片成熟片，迅速測定相對電導率，每個處理12次重復。

1.3 電導率測定及計算

細胞膜透性的測定采用相對電導率法[11]：取低溫處理前后各組茶苗完整葉片一份，用打孔器避開主葉脈打孔若干，隨機取10 片放入干凈的試管中，加入10 mL去離子水，3次重復。用真空泵抽濾30 min，在25℃下用電導儀測定電導率 T1。再將試管放入沸水中10 min，冷卻至25℃，測定電導率T2。相對電導率=（T1/ T2）×100%。所有數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 外源NO對碧香早、湘妃翠、白毫早和湘波綠葉片相對電導率的影響

從圖1和圖2中可以看出，碧香早和湘妃翠兩個茶樹品種的相對電導率變化趨勢基本一致，隨著低溫處理時間的延長，各處理葉片的相對電導率呈先上升后緩慢下降的趨勢。0 h時，3個處理葉片的相對電導率基本一致。低溫處理8 h后，葉片的相對電導率急劇上升，以0 mmol/LSNP處理的葉片相對電導率最高，0.2和0.5 mmol/L SNP處理的葉片相對電導率較低。這說明葉片受到低溫脅迫后，細胞膜透性增大，電解質外滲，相對電導率明顯上升，但外源噴施SNP可減緩茶樹葉片相對電導率增加的速度。低溫處理24 h后，0 mmol/LSNP處理的葉片相對電導率在緩慢下降，0.2和0.5 mmol/L SNP處理的下降幅度相對較大，且0.2 mmol/L SNP處理的相對電導率最小。這可能是因為低溫脅迫8 h后茶樹體內抗寒基因開始表達，而外源SNP可提高抗寒基因的表達水平，降低細胞膜透性，從而使葉片的相對電導率下降，且0.2 mmol/LSNP濃度最有利于茶樹抗寒性的增強。低溫處理48 h時，各處理相對電導率趨于穩(wěn)定，其大小規(guī)律與處理24 h時一致，即0.2 mmol/L<0.5 mmol/L<0 mmol/L。

從圖3和圖4中可以看出，白毫早和湘波綠各處理的變化規(guī)律與碧香早和湘妃翠大致相同。白毫早0.2 mmol/L SNP處理在低溫處理8～48 h時，葉片相對電導率整體較低；8 h和48 h時最低，但8～24 h時0.5 mmol/L SNP處理的葉片相對電導率下降速度較快，使其在24 h時低于0.2 mmol/LSNP處理，而0.2 mmol/LSNP處理的葉片相對電導率一直在緩慢下降，使48 h時0.2 mmol/LSNP處理的相對電導率低于0.5 mmol/LSNP處理。這說明白毫早在不同低溫處理時間對外源SNP響應程度有差異。湘波綠各個處理在處理0～24 h內相對電導率一直上升，處理24～48 h才緩慢下降。這可能是因為湘波綠在低溫脅迫后，自身調節(jié)能力相對較弱，其抗寒基因表達的反應時間較長，即湘波綠的抗寒性不及其他三個品種。

2.2 低溫脅迫和SNP處理下茶樹葉片電導率的相對下降量

從表1中可以看出， 0.2 mmol/LSNP處理4個品種，在低溫脅迫24 h和48 h時葉片的電導率相對下降量基本高于0.5 mmol/LSNP處理，而在8 h時的變化規(guī)律不明顯。碧香早品種，除低溫處理8 h時，0.5 mmol/L處理的葉片電導率相對下降量較大外，其他均以0.2 mmol/L處理的電導率相對下降量較大，尤其是低溫處理24 h時，電導率相對下降量最大，達7.37%。

湘妃翠品種，電導率相對下降量的變化規(guī)律與碧香早相同，低溫處理24和48 h時，0.2 mmol/L SNP處理的葉片電導率相對下降量分別達6.68%和6.63%；說明碧香早和湘妃翠在低溫處理24 h時，0.2 mmol/L SNP對葉片質膜的保護效果最好。

白毫早品種，也是以0.2 mmol/L SNP處理對低溫脅迫時電導率上升的緩解效果較好，其相對下降量均大于0.5 mmol/L SNP處理；低溫處理48 h時，電導率相對下降量最大，為7.23%，而低溫處理24 h時，相對下降量較小。

湘波綠品種，電導率相對下降量的變化規(guī)律與白毫早基本一致，但其相對下降量較小，低溫處理48 h時，0.2 mmol/L SNP處理的電導率相對下降量最大，為5.88%。

綜上所述，說明白毫早和湘波綠在低溫脅迫下0.2 mmol/L SNP處理對降低葉片相對電導率的作用效果好于0.5 mmol/L的處理，但對這兩個品種的作用效果不及碧香早和湘妃翠明顯，且需至48 h時葉片電導率相對下降量才能達到最高值。

3 討論與結論

判斷植物抗寒能力大小的指標之一是細胞膜通透性的變化大小。細胞膜是凍害損傷的關鍵部位，是阻止胞外結冰向胞內結冰擴展的天然屏障。低溫可使細胞通透性增加，膜透性增大，細胞內電解質大量外滲，從而使細胞受到損害，甚至死亡。相對電導率是檢驗植物受逆境脅迫后細胞膜受損傷程度的重要指標[12]。

研究表明，每0.5 mmol/L SNP大約可釋放2.0 μmol/L的NO[13]。植物體中，NO的功能具有二元性：低濃度的NO對植物體具有一定的保護作用，而高濃度NO則會嚴重傷害植物組織和細胞[14]。前人研究認為，外源SNP能降低低溫脅迫下黑麥草幼苗質膜相對透性[15]，隨著SNP濃度的增加低溫脅迫下玉米葉片相對電導率逐漸下降，且以100 mmol/L的SNP對低溫脅迫的緩解效果最佳[16]。

試驗結果表明，不同濃度的SNP處理對4個茶樹品種葉片相對電導率的緩解效果均以0.2 mmol/L的SNP表現(xiàn)最佳，其次為0.5 mmol/L的SNP處理，這與前人研究結果相似，即適宜濃度的外源SNP可以降低低溫脅迫下茶樹葉片相對電導率；但SNP濃度升高，其作用效果減弱。

在低溫處理過程中，4個茶樹品種葉片的相對電導率對外源SNP響應效果有差異。低溫脅迫24 h時，0.2 mmol/L SNP處理對碧香早和湘妃翠的葉片電導率相對下降量分別達7.37%和8.68%；而低溫脅迫48 h時，0.2 mmol/L SNP處理對白毫早和湘波綠的葉片電導率相對下降量分別達7.23%和5.88%。這可能是由于4個茶樹品種自身的抗寒性有差異，導致0.2 mmol/LSNP對不同品種的作用效果不一致，具體原因還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 陳宗懋. 中國茶葉大辭典[M ]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[2] 陳 喧，房婉萍，鄒中偉，等. 茶樹冷脅迫誘導抗寒基因CBF的克隆與表達分析[J]. 茶葉科學，2009，28（4）：53-59.

[3] 程國山，游新才，武 艷，等. 低溫脅迫后抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’的基因差異表達分析[J]. 植物資源與環(huán)境學報，2013，22（4）：38-43.

[4] Wendehenne D，Durner J，Klessig D F. Nitric oxide：a new player in plant signaling and defence response[J]. Current Opinion in Plant Biology，2004，7（4）：449-455.

[5] Maria C P，F(xiàn)ranca T，Laura D G. Changes in the antioxidant systems as part of the signaling pathway responsible for the programmed cell death activated by Nitric oxide and ROS in tobacco BY-2 cells[J]. Plant Physiology，2002，130：698-708.

[6] 徐洪雷，于廣建. 一氧化氮（NO）對黃瓜低溫脅迫的緩解作用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（5）：606-608.

[7] 吳錦程，陳建琴，梁 杰，等. 外源一氧化氮對低溫脅迫下枇杷葉片ASA-GSH循環(huán)的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2009，20（6）：1395-1400.

[8] 湯紅玲，李 江，陳慧萍. 外源——氧化氮對香蕉幼苗抗冷性的影響[J]. 西北植物學報，2010，30（10）：2028-2033.

[9] 于秀針. NO對低溫脅迫下番茄幼苗生長特性的影響機制研究[D]. 石河子：石河子大學碩士學位論文，2010.

[10] 王偉東，蔣 芯，堵昱林，等. 低溫對茶樹花粉管抑制作用與NO關系的研究[J]. 園藝學報，2013，40（8）：1535-1540.

[11] 王文舉，張亞紅，牛錦鳳，等. 電導法測定鮮食葡萄的抗寒性[J]. 果樹學報，2007，24（1）：34-37.

[12] 王連榮，劉鐵錚. 果樹抗寒生理與防寒措施的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，18：9483-9484.

[13] Delledonne M，Xia Y，Dixon R A，et al. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance[J]. Nature，1998，394：585-588.

[14] 肖 強，鄭海雷. 一氧化氮與植物脅迫響應[J]. 植物生理學通訊，2004，40（3）：379-384.

[15] 馬向麗，魏小紅，龍瑞軍，等. 外源一氧化氮提高一年生黑麥草抗冷性機制[J]. 生態(tài)學報，2005，25（6）：1270-1274.

[16] 陳銀萍，王曉梅，楊宗娟，等. NO對低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2012，31（2）：270-277.

（責任編輯：成 平）