23株海洋真菌的分子鑒定及其抗植物病原真菌和細(xì)胞毒活性研究

楊小嵐陳玉嬋李浩華章衛(wèi)民

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

23株海洋真菌的分子鑒定及其抗植物病原真菌和細(xì)胞毒活性研究

楊小嵐1，2，3陳玉嬋2李浩華2章衛(wèi)民2

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

從南海沉積物中分離得到23株海洋真菌，通過ITS測序進(jìn)行鑒定。以新月彎孢霉（Curvularia lunata）、柱枝雙胞霉（Cylindrocladium scoparium）、鏈格孢（Alternaria alternata）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）為受試植物病原真菌，以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（SF-268）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H460）和肝癌細(xì)胞（HepG-2）為受試腫瘤細(xì)胞，分別采用生長速率法和SRB法對這些菌株的發(fā)酵液粗提物進(jìn)行抗植物病原真菌和細(xì)胞毒活性測試，發(fā)現(xiàn)11個菌株的粗提物在濃度為50 mg/mL時，對至少1種受試植物病原真菌的抑制率在50%以上，有9個菌株的粗提物在濃度為100 μg/mL時，對至少1種腫瘤細(xì)胞株的抑制率在80%以上，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110、Acaromyces ingoldiiFS121對植物病原真菌和（或）腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制活性。

海洋真菌 分子鑒定 提取物 抗植物病原真菌 細(xì)胞毒活性

生命起源于海洋，海洋生物種類繁多，按生物學(xué)統(tǒng)計高達(dá)30多門50余萬種，生物總量占地球生物總量的87%，然而海洋生物的資源利用率不到1%［1］。海洋生物的生活環(huán)境與陸生生物相比有較大不同，高鹽、高壓、寡營養(yǎng)、低溫且相對恒溫以及有限的光照和缺氧等特殊的生長環(huán)境，使得海洋生物次生代謝的途徑和酶反應(yīng)機(jī)制與陸地生物幾乎完全不同［2］，海洋微生物尤其是海洋真菌，以其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、生物活性高等特點成為拓展天然藥用資源的新空間，也是目前資源最豐富、保存最完整的、最具有新藥開發(fā)潛力的領(lǐng)域［3-5］。到目前為止，已從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1 117個新的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性［3，6，7］。

作者對分離自中國南海海洋沉積物樣品的23株真菌進(jìn)行分子鑒定，通過其發(fā)酵液粗提物的活性測試，從中篩選具有抗植物病原真菌或細(xì)胞毒活性的菌株，旨在發(fā)掘具有潛在應(yīng)用前景的高活性菌株，為開發(fā)新的微生物藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海洋真菌、供試植物病原真菌和細(xì)胞株 23株海洋真菌于2011年9月從南海沉積物樣品中分離得到。供試植物病原真菌為新月彎孢霉（Curvularia lunata）購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）、柱枝雙胞霉（Cylindrocladium scoparium）、鏈格孢（Alternaria alternata）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)姜子德教授提供。

供試腫瘤細(xì)胞株為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（SF-268）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H460）、肝癌細(xì)胞（HepG-2），由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室蔣繼宏教授提供。以上所有菌株和細(xì)胞株均保藏于廣東省微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 植物病原真菌菌株的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂18 g，加水至1 L；海洋真菌的培養(yǎng)基為含有1.5%粗海鹽的PDA培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基為含有1.5%粗海鹽的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和1%雙抗（10 000 U/mL青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑Taq酶及其他的 PCR 相關(guān)試劑購于大連寶生物工程有限公司，其他分析純化學(xué)試劑均為市售。

1.2 方法

1.2.1 海洋真菌菌株的分離純化 無菌條件下稱取沉積物樣品約1 g，加入無菌海水 9 mL，振蕩混勻，再分別稀釋 10倍和100倍，共制成 3 個濃度梯度的樣品，各取 0. 2 mL 涂布于含1.5%粗海鹽的PDA固體培養(yǎng)基，每個梯度涂布多個平板，28℃培養(yǎng)，每天觀察并挑出單個生成菌落，純化后接種于PDA斜面培養(yǎng)基。

1.2.2 海洋真菌的分子鑒定 基因組DNA的提取方法參照SDS-CTAB法［8］。PCR擴(kuò)增采用真菌ITS rDNA的通用引物ITS1（5'-TCCGATGGTGAACCTGCG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［9］擴(kuò)增分離菌株的ITS rDNA區(qū)。PCR采用20 μL反應(yīng)體系，通過ExTaq（TaKaRa）進(jìn)行，反應(yīng)條件為93℃預(yù)變性3 min；93℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（QIAGEN）純化，純化后的樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序，測序獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析，初步確定海洋真菌的種類。

1.2.3 菌株粗提物浸膏的制備 將低溫保藏的斜面菌種分別接種到PDA平板上，28℃活化3 d，挑取各菌株接種到含有1.5%粗海鹽的PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，用四層紗布過濾收集發(fā)酵液。用乙酸乙酯等體積萃取發(fā)酵液4次，合并萃取液于40℃減壓濃縮，得到各菌株粗提物浸膏。

1.2.4 細(xì)胞毒活性測定 采用SRB法［10］測定發(fā)酵液提取物對腫瘤細(xì)胞NCI-H460、SF-268、MCF-7和HepG-2的生長抑制率，各粗提物的濃度為100 μg/mL，以順鉑作為陽性對照，濃度為20 μg/mL，每處理重復(fù)3次。

1.2.5 抗植物病原真菌活性篩選 采用生長速率法［11］測定發(fā)酵液提取物抗植物病原真菌活性：將各粗提物浸膏分別溶于DMSO，濃度為50 mg/mL。取樣品提取液0.1 mL均勻涂布到PDA平板上，從活化后的植物病原真菌菌落邊緣，取直徑為4 mm的菌餅置于培養(yǎng)皿中央，每處理重復(fù)3次，以DMSO代替樣品作為空白對照。28℃恒溫培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法記錄菌餅生長直徑，計算抑制率。

其中，純生長量（mm）=菌餅生長直徑（mm）-4 1.2.6 最低抑菌濃度的測定 根據(jù)抗植物病原真菌活性篩選結(jié)果，選取高活性菌株進(jìn)一步測定其最低抑制濃度（MIC），測定方法參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥敏試驗參考方案》進(jìn)行。向無菌96孔板的A-G孔分別加入100 μL用PDB培養(yǎng)基倍比稀釋的待測樣品，使各孔的最終樣品濃度為12.5、6.25、 3.125、1.5625、0.7812、0.3906和0.1953 mg/mL，再向每孔中分別加入106-107CFU/mL病原真菌菌懸液100 μL，以DMSO代替樣品作為空白對照。每處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)72 h后根據(jù)菌株的生長狀況判斷最小抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 海洋真菌的分子鑒定

自中國南海沉積物樣品中共分離得到23株不同的海洋真菌，將測序后獲得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果分別鑒定為7株青霉屬（Penicillium）真菌、6株曲霉屬（Aspergillus）真菌、3株枝孢菌屬（Cladosporium）真菌、2株正青霉屬（Eupenicillium）真菌以及熱帶莖點霉（Phoma tropica）、外瓶霉（Exophialasp.）、埃德菌（Dichotomomyces cejpii）、棘殼孢菌（Pyrenochaetasp.）和類酵母真菌（Acaromyces ingoldii）各1株（表1）。

2.2 細(xì)胞毒活性測定

各菌株發(fā)酵液提取物的細(xì)胞毒活性測試結(jié)果見表2。從表2可以看出，有3株海洋真菌對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的抑制率在80%以上；有8株對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制率在80%以上；有4株對肺癌細(xì)胞NCI-H460的抑制率在80%以上；有3株對肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制率在80%以上，其中菌株Dichotomomyces cejpiiFS110和Acaromyces ingoldiiFS121對所有受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率均在90%以上，Eupenicilliumsp. FS100對所有受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率在80%以上。

2.3 抗植物病原真菌活性測定

抑菌試驗結(jié)果（表3）顯示有11株真菌的發(fā)酵液提取物對至少1種受試植物病原真菌的抑制率在50%以上，其中有3個菌株的抑菌效果顯著，菌株Dichotomomyces cejpiiFS110的抑菌效果尤為突出，對膠孢炭疽菌、鏈格孢、新月彎孢霉和柱枝雙胞霉的抑制率均在90%以上，Penicilliumsp. FS105對膠孢炭疽菌和新月彎孢霉的抑制率分別為96.90%、90.57%，Eupenicilliumsp. FS100對鏈格孢的抑制率為94.20%。

2.4 最小抑菌濃度測定

選取抗植物病原真菌活性顯著的3個菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105和Dichotomomyces cejpiiFS110，測定其發(fā)酵液提取物對上述4種植物病原真菌的最小抑菌濃度，結(jié)果（表4）顯示FS110發(fā)酵液提取物對4種受試植物病原真菌的最小抑菌濃度均為≤0.20 mg/mL，F(xiàn)S100對鏈格孢的最小抑菌濃度為≤0.20 mg/mL；FS105對膠孢炭疽菌的最小抑菌濃度為≤0.20 mg/mL。

3 討論

海洋真菌的次生代謝產(chǎn)物是抗癌、抗細(xì)菌、抗病毒、抗病原真菌藥物的巨大資源寶庫［12，13］。對海洋資源的開發(fā)利用、海洋活性菌株的篩選以及活性成分的分離純化成為當(dāng)今研究的熱點［14］。為了從海洋真菌中發(fā)掘新型藥用天然產(chǎn)物，作者對南海海洋沉積物中分離到的23株海洋真菌進(jìn)行了分子鑒定，并從中篩選到11株抗植物病原真菌抑制率在50%以上的菌株和9株對腫瘤細(xì)胞抑制率在80%以上的菌株，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110和Acaromyces ingoldiiFS121具有明顯的抗植物病原真菌活性和（或）細(xì)胞毒活性。

Dichotomomyces cejpii曾經(jīng)從日本的海域［15］以及日本、荷蘭、丹麥、印度的土壤［16］中分離得到。1999年P(guān)ieckovó等［17］發(fā)現(xiàn)菌株D. cejpii的提取物具有廣譜的抗菌效果，甚至對一些耐藥菌也有較好的抑制效果。2007年Ogata等［18］從菌株D. cejpiivar.cejpiiNBRC 103559的菌絲體中分離得到一種新的吲哚雙萜（JBIR-03），該化合物能有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和蘋果樹腐爛病菌（Valsa ceratosperma）。本研究首次從南海深海沉積物中分離獲得菌株D. cejpiiFS110，經(jīng)細(xì)胞毒活性測試，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物對腫瘤細(xì)胞株NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2具有顯著的抑制活性，對植物病原真菌也有明顯的抑制作用。Acaromyces ingoldii為一種稀有的類酵母真菌，是Acaromyces屬內(nèi)唯一的已知種，由Boekhout等［19］于2003年首次從以色列的葡萄柚葉片上的柑橘銹蜱（citrus rust mite）中分離得到。2005年，Yasuda［20］從日本水梨果實的病斑上分離到該菌菌株P(guān)FS 007。2009年，魏育慧等［21］從臺灣的木天蓼植株表面也分離得到該菌菌株BCRC 08F0505。據(jù)報道，該真菌在生物防治的應(yīng)用上頗具潛力［22］。本研究首次從南海深海環(huán)境中分離得到菌株A.ingoldiiFS121，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物具有顯著的細(xì)胞毒活性，對4種受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率均在90%以上。此外，菌株Eupenicilliumsp. FS100的發(fā)酵液提取物也具有較好的細(xì)胞毒活性，對4種受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率均在85%以上，而菌株P(guān)enicilliumsp. FS105的發(fā)酵液提取物則對膠孢炭疽菌和新月彎孢霉有明顯的抑制活性，抑制率分別達(dá)到96.9%和90.6%。因此，本研究篩選獲得的4株海洋真菌FS100、FS105、FS110、FS121具有重要的研究價值，值得進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究從南海沉積物中分離鑒定了23株海洋真菌，經(jīng)活性測試結(jié)果顯示有11株海洋真菌的發(fā)酵液提取物對至少1種受試植物病原真菌的抑制率在50%以上，有9株對至少1種受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率在80%以上，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110、Acaromyces ingoldiiFS121對植物病原真菌和（或）腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制活性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Molecular Identification of 23 Marine Fungal Strains and Their Activities Against Plant Pathogenic Fungi and Cytotoxic Activities

Yang Xiaolan1，2，3Chen Yuchan2Li Haohua2Zhang Weimin2
（1. South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301；2. State Key Laboratory of Applied Microbiology，South China（the Ministry-Province Joint Development），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）

Twenty three marine fungal strains were isolated from the sediments of the South China Sea and identified by intergenic transcribed spacer（ITS）sequencing. The fermentation broth extracts of these marine fungal strains were tested for their inhibitory activities against growth of 4 plant pathogenic fungi, namelyColletotrichum gloeosporioides,Alternaria alternate,Curvularia lunata, Cylindrocladium scoparium, and investigated for their cytotoxic activities against SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2 tumor cell lines by the SRB method. The results showed the extracts of 11 strains presented higher than 50% inhibitory rates against at least one of those plant pathogenic fungi at a concentration of 50 mg/mL and the extracts of 9 strains presented higher than 80% inhibitory rates against at least one of those tumor cell lines at a concentration of 100 μg/mL. Among all strains studied,Eupenicilliumsp. FS100,Penicilliumsp. FS105,Dichotomomyces cejpiiFS110 andAcaromyces ingoldiiFS121 exhibited obvious inhibitory activities against plant pathogenic fungi and/or tumor cell lines.

Marine fungi Molecular identification Extract Activity against plant pathogenic fungi Cytotoxicity

2013-12-18

國家自然科學(xué)基金項目（31272087），國家“863”計劃資助項目（2012AA092104），廣東省自然科學(xué)基金項目（S2013010014557），廣州市科技計劃項目（2013J4100067）

楊小嵐，女，碩士研究生，研究方向：海洋微生物活性代謝產(chǎn)物；E-mail：1617694366@qq.com

章衛(wèi)民，男，博士，研究員，研究方向：藥用微生物資源及其活性物質(zhì)；E-mail：wmzhang58@qq.com