喜鹽鳶尾Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因IhNHX1的克隆及序列分析

趙沿海， 原海燕， 顧春筍， 黃蘇珍

〔江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210014〕

在鹽脅迫環(huán)境中，Na+是危害植物生長發(fā)育甚至存活的主要脅迫離子，高濃度Na+可嚴(yán)重干擾植物對礦質(zhì)元素的吸收并影響氣孔的開關(guān)及一些依賴K+活化胞質(zhì)酶的活性[1-2]。Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX，Na+/H+antiporter)是位于細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上的一類跨膜載體蛋白，它可以利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPase提供驅(qū)動力建立跨膜質(zhì)子梯度，將Na+和K+離子排出細(xì)胞質(zhì)，減少Na+對細(xì)胞的毒害作用，從而提高植物的抗鹽能力[3-4]。1976年，Murer等[5]在老鼠腎細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)NHX蛋白；同年，Ratner等[6]在大麥(HordeumvulgareLinn.)質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)；1985年，Blumwald等[7]在甜菜(BetavulgarisLinn.)根部的液泡膜上也發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)。NHX1蛋白在植物體中含量豐富且分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)的NHX基因共有6種，表現(xiàn)出不同的時(shí)空表達(dá)模式；根據(jù)分布位置的不同及序列的相似性，可以將NHX基因分為2組[8-10]，一組為NHX1至NHX4，均分布在液泡膜上；另一組為NHX5和NHX6，主要分布在高爾基體及反面高爾基網(wǎng)上，在內(nèi)涵體物質(zhì)運(yùn)輸?shù)揭号菁罢{(diào)節(jié)內(nèi)涵體pH值上發(fā)揮作用。

NHX蛋白屬于結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)，在無鹽條件下活性較低；經(jīng)過鹽處理后，NHX蛋白的合成及活性均增加，表明該蛋白質(zhì)與植物耐鹽性密切相關(guān)[11]。目前，許多研究均證實(shí)NHX蛋白在植物耐鹽方面起重要作用。例如：在NHX基因突變的酵母中表達(dá)擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕NHX基因后可以使酵母由鹽敏感型轉(zhuǎn)變?yōu)辂}耐受型[12]；在水稻(OryzasativaLinn.)體內(nèi)過量表達(dá)其自身的NHX基因能夠提高其耐鹽性[13]； Li等[14]的研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)marker-freeAtNHX1基因的玉米(ZeamaysLinn.)的抗旱性及產(chǎn)量都有一定程度的提高；Wu等[15]認(rèn)為：在霸王〔Zygophyllumxanthoxylum(Bunge) Maxim.〕耐鹽脅迫和干旱脅迫中ZxNHX基因均有重要作用；Apse等[16]在擬南芥中過量表達(dá)AtNHX1基因，可顯著提高擬南芥的耐鹽性；Zhang等[17]將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入番茄(LycopersiconesculentumMill.)中并過量表達(dá)也可顯著提高其耐鹽性。

喜鹽鳶尾(IrishalophilaPall.)為多年生宿根性草本植物，主要分布于新疆、甘肅和內(nèi)蒙古[18]。喜鹽鳶尾具有很強(qiáng)的耐寒性和耐旱性，觀賞價(jià)值很高；其根、花和種子均可入藥，具有清熱解毒、利尿和止血等功效[19]。此外，喜鹽鳶尾還是一種典型的鹽生植物，在含308 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)液中仍然能夠生長良好[20]，對植物耐鹽性的研究具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。

為明確喜鹽鳶尾耐鹽的分子機(jī)制，作者采用同源克隆和RACE法克隆獲得喜鹽鳶尾IhNHX1基因的全長序列，并對該基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析；對該基因編碼的氨基酸序列與另外11種植物NHX1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)樹分析，并分析了IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域，以期為喜鹽鳶尾耐鹽基因的挖掘與利用研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用喜鹽鳶尾種子為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。將喜鹽鳶尾幼苗用1/2 Hoagland營養(yǎng)液水培15 d后，用含308 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液水培1 d，采集新鮮葉片用于總RNA提取。

實(shí)驗(yàn)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、rTaqDNA聚合酶、TdT末端加尾酶、T4-DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、MiMiBEST DNA純化試劑盒和Marker 2000均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；抗生素及其他相關(guān)試劑購自上海浩嘉生物工程公司；RNA提取試劑Trizol plus為南京天為生物科技有限公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)化使用的菌株為大腸桿菌DH5α。

引物合成均由上海捷瑞生物工程有限公司完成；測序則由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)Trizol plus試劑說明書上的方法，用喜鹽鳶尾鮮葉提取總RNA，并使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA第1條鏈，即cDNA。

1.2.2 基因中間序列的克隆 根據(jù)GenBank中已登錄的NHX1同源基因的核苷酸序列和氨基酸序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行序列同源性在線比對，并分析它們的保守區(qū)域；利用CODEHOP軟件、根據(jù)保守區(qū)序列在線設(shè)計(jì)兼并引物。引物NM1的序列為5′-CA TCTTCAACGCCGGCTTYCARGTNAA-3′；引物NM2的序列為5′-TCGGTCACGTTGTGCCANGTRTA-3′。其中，R=A/G、Y=C/T、N=A/C/G/T。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括模板250 ng、10×PCR buffer (含Mg2+) 2.5 μL、dNTPs混合液(各2.5 mmol·L-1) 2 μL、正反向引物各1μL、rTaqDNA聚合酶0.15 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性 40 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸5 min。

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠回收，然后連接到pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有50 μL·mL-1氨芐青霉素(ampicillin)的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)；分別挑取單菌落，接種至含有相同濃度氨芐青霉素的1 mL LB液態(tài)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3 h后，對培養(yǎng)菌液的DNA進(jìn)行PCR鑒定；將含有目的條帶(即IhNHX1基因中間序列)的樣品送測序公司進(jìn)行測序。

1.2.3 基因3′端序列的克隆 采用3′RACE方法[21]克隆NHX1基因的3′端序列，利用Oligo 7軟件、根據(jù)測序獲得的IhNHX1基因中間序列設(shè)計(jì)3′端通用PCR引物和特異PCR引物。通用引物Olig(dT) primer的序列為5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTT TTTTT-3′，通用引物dT-AP的序列為5′-GACTCG AGTCGACATCGA-3′；特異引物N31的序列為5′- CATTTGCTGGATTGCTTAGTGC-3′，特異引物N32的序列為5′-AGGCATTCTACTGATCGTGAAG-3′。

使用通用引物Olig(dT) primer逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板、用特異引物N31和通用引物dT-AP進(jìn)行第1輪巢式PCR；再以第1輪巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后的溶液為模板、用特異引物N32和通用引物dT-AP進(jìn)行第2輪巢式PCR。巢式PCR的擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸7 min。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆后，測序得到IhNHX1基因的3′端序列。PCR反應(yīng)體系和轉(zhuǎn)化、克隆等方法同上。

1.2.4 基因5′端序列的克隆 采用5′RACE方法[22]克隆NHX1基因的5′端序列，利用Oligo 7軟件、根據(jù)測序獲得的IhNHX1基因中間序列設(shè)計(jì)5′端正向PCR引物和反向特異PCR引物。正向引物5AP的序列為5′-GATGCGACTGCTCACTGACTGACTCTGACCGCATC GGGGGGGGGGH-3′， 正向引物5NP1的序列為5′-GATGCGACTGCTCACTGACTG-3′，正向引物5NP2的序列為5′-TGACTGACTCTGACCGCATC-3′；反向特異引物N51的序列為5′-CAAATGCTCCCAAGAAGGTG-3′，反向特異引物N52的序列為5′-ATCGAAGTTCT GTATTGCGTT-3′，反向特異引物N53的序列為5′-GCACCAAGAGAAATTATGACGAA-3′。

用反向特異引物N51逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；經(jīng)MiMiBEST DNA純化試劑盒純化后，用TdT末端加尾酶為cDNA加上Poly(C)尾；以加尾后的cDNA為模板、用正向引物5AP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成互補(bǔ)并加接頭的雙鏈DNA。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性60 s；94 ℃變性20 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸70 s，共5個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸5 min。

以加接頭的雙鏈DNA為模板、用正向引物5NP1和反向特異引物N52進(jìn)行第1輪巢式PCR；再以第1輪巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后的溶液為模板、用正向引物5NP2和反向特異引物N53進(jìn)行第2輪巢式PCR。巢式PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃預(yù)變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸5 min。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆后，測序得到IhNHX1基因的5′端序列。PCR反應(yīng)體系和轉(zhuǎn)化、克隆等方法同上。

1.3 序列及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

采用DNAMAN軟件對克隆得到的5′端、3′端和中間序列進(jìn)行首尾拼接，得到IhNHX1基因的全序列；使用Oligo 7軟件分析該基因編碼的氨基酸序列。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取與IhNHX1基因編碼的氨基酸序列BLAST相似度大于80%的11種植物的同源氨基酸序列，通過Clustal W軟件分析NHX1基因編碼的氨基酸序列的保守性，并基于此基因編碼的氨基酸序列、利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構(gòu)建12種植物的系統(tǒng)樹。采用SOPMA軟件在線分析IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，并通過TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果和分析

2.1 IhNHX1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物分別對喜鹽鳶尾IhNHX1基因的中間序列、5′端序列和3′端序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。擴(kuò)增得到的IhNHX1基因中間序列的片段長度約為600 bp，5′端序列的片段長度約為500 bp， 3′端序列的片段長度約為1 100 bp。

2.2 IhNHX1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列分析

采用DNAMAN軟件將克隆獲得的喜鹽鳶尾IhNHX1基因的5′端序列、中間序列及3′端序列進(jìn)行首尾拼接后得到1條全長1 946 bp 的cDNA序列。通過Oligo 7軟件分析可知： 該基因包含1個(gè)長度為1 611 bp的開放閱讀框(ORF)，其編碼的蛋白質(zhì)共包含537個(gè)氨基酸。該基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列詳見圖2。

2.3 IhNHX1基因及其他植物NHX基因編碼的氨基酸序列比較及同源性分析

氨基酸序列比較結(jié)果(表3)表明：喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的氨基酸序列與平滑獐毛〔Aeluropuslagopoides(Linn.) Trin. ex Thwaites〕、雙稃草〔Diplachnefusca(Linn.) Kunth〕、結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud.)、蘆葦〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕、玉米、毛竹〔Phyllostachysedulis(Carr.) J. Houz.〕、可可(TheobromacacaoLinn.)、小米〔Setariaitalica(Linn.) P. Beauv.〕、葡萄(VitisviniferaLinn.)、甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck〕和金錢橘(CitrusclementinaHort.)11種植物NHX1基因編碼的氨基酸序列的一致性高達(dá)96.2%(圖中彩色區(qū)域所示)，其中完全一致的序列占61.7%(圖中黃色區(qū)域所示)，表明該氨基酸序列保守性較高。

M： 分子量標(biāo)記Marker 2000； 1： 中間序列Middle sequence； 2： 5′端序列 5′ end sequence； 3： 3′端序列 3′ end sequence.

圖2 喜鹽鳶尾IhNHX1基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

A: 氨氯吡嗪結(jié)合位點(diǎn) Ammonia chloride pyrazine binding site; B: CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域 CaM binding domain.

此外，喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的氨基酸序列上有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域即圖3中的黑框A和黑框B，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域均為NHX1蛋白上極為保守的結(jié)構(gòu)域[23]。其中，黑框A為NHX1蛋白上的氨氯吡嗪結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)是NHX1蛋白的標(biāo)志性結(jié)合位點(diǎn)；黑框B為NHX1蛋白上的CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是NHX1蛋白的重要調(diào)節(jié)區(qū)域。

基于喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的氨基酸序列與上述11種植物NHX1蛋白的氨基酸序列、利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果見圖4。整體上看，同科植物間的親緣關(guān)系最近，如禾本科(Poaceae)植物平滑獐毛、雙稃草、結(jié)縷草、蘆葦、玉米和小米之間的分支長都在0.1以內(nèi)，而蕓香科(Rutaceae)植物甜橙與金錢橘之間的分支長為0。在此系統(tǒng)樹中，喜鹽鳶尾與其他植物的分支長均大于1.2，表明從NHX1蛋白的氨基酸序列來看，喜鹽鳶尾與其他11種植物間的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

2.4 IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA軟件在線分析喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5；通過TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見圖6。由圖5可見：在喜鹽鳶尾IhNHX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋(αhelix)占48.60%，不規(guī)則卷曲(random coil)占32.03%，延伸鏈(extended strand)占14.71%，氫鍵轉(zhuǎn)角(hydrogen bonding turn)占4.66%。由圖6可見：喜鹽鳶尾IhNHX1蛋白共包含10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

IH: 喜鹽鳶尾Iris halophila Pall.; CS: 甜橙Citrus sinensis (Linn.) Osbeck; CC: 金錢橘Citrus clementina Hort.; TC: 可可Theobroma cacao Linn.; VV: 葡萄Vitis vinifera Linn.; PE: 毛竹Phyllostachys edulis (Carr.) J. Houz.; AL: 平滑獐毛Aeluropus lagopoides (Linn.) Trin. ex Thwaites; DF: 雙稃草Diplachne fusca (Linn.) Kunth; ZJ: 結(jié)縷草Zoysia japonica Steud.; PA: 蘆葦Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud.; SI: 小米Setaria italica (Linn.) P. Beauv.; ZM: 玉米Zea mays Linn.

h: α螺旋 α helix； e： 延伸鏈 Extended strand； c： 不規(guī)則卷曲 Random coil； t: 氫鍵轉(zhuǎn)角 Hydrogen bonding turn.

圖6 喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域

3 討論和結(jié)論

通過同源克隆和RACE方法克隆獲得喜鹽鳶尾IhNHX1基因的全序列，序列總長度為1 946 bp，包含1個(gè)長度為1 611 bp的開放閱讀框(ORF)，共編碼537個(gè)氨基酸。喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的氨基酸序列與其他11種植物NHX1基因編碼的氨基酸序列的保守性均較高，存在很多完全一致的序列，這些保守區(qū)應(yīng)是IhNHX1基因的功能區(qū)；而從系統(tǒng)樹上卻可看出喜鹽鳶尾與其他11種植物的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。上述研究結(jié)果說明，在進(jìn)化過程中，植物蛋白質(zhì)功能區(qū)域序列的保守性能夠有效保證該蛋白質(zhì)的活性。比較分析結(jié)果表明：喜鹽鳶尾IhNHX1基因編碼的氨基酸序列與其他11種植物NHX1基因編碼的氨基酸序列在非相同區(qū)域的差異較大，這些差異是否與喜鹽鳶尾具有較高的耐鹽性有關(guān)?尚有待對IhNHX1基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

對IhNHX1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)的α螺旋所占比例最高，達(dá)48.60%；不規(guī)則卷曲占32.03%，并且該蛋白質(zhì)由10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成。Yamaguchi等[24]通過蛋白酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明：擬南芥的液泡膜NHX蛋白由12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，并提出1個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型?？梢?，喜鹽鳶尾的IhNHX1蛋白結(jié)構(gòu)模型與Yamaguchi等提出的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型存在一定差異。

通常，在使用經(jīng)典的5′RACE方法克隆基因的5′端時(shí)，很容易產(chǎn)生很多非特異性條帶，難以辨別目的條帶，對此，有研究者已提出很多改進(jìn)的5′RACE方法[25]。在本研究中，作者在經(jīng)典5′RACE方法基礎(chǔ)上，結(jié)合一些通用的5′端引物對5′端正向引物進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，提高了PCR擴(kuò)增的特異性。具體步驟如下：首先，在5AP引物的特異序列部分設(shè)計(jì)能夠自身環(huán)化或形成雙鏈的序列，以便露出Poly(G)尾與模板鏈上的Poly(C)結(jié)合；其次，在5AP引物末端加入兼并堿基H(A/T/C)，使之可以與除C外的其他堿基配對，幫助該引物錨定在模板Poly(C)尾結(jié)束的第1個(gè)堿基上；再次，設(shè)計(jì)了2條巢式PCR引物，即5NP1和5NP2，通過巢式PCR擴(kuò)增減少非特異條帶。此外，5AP引物中的Poly(G)部分連續(xù)超過5個(gè)G的序列較難合成，可以參照AAP引物序列“GGCCACGCGT CGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG”的Poly(G)部分進(jìn)行合成，即在引物Poly(G)中增加稀有堿基I，即GGGGIIGGGGIIGGGG。以上引物優(yōu)化設(shè)計(jì)對基因5′端正向引物的設(shè)計(jì)有一定的借鑒作用，但由于不同基因的5′端結(jié)構(gòu)存在一定差異，因此，不同基因的5′端正向引物還需要通過不同的優(yōu)化設(shè)計(jì)才能取得較好的擴(kuò)增效果。

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