超聲波破碎輔酶Q10工藝研究

朱勇峰等

摘 要：通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對超聲波提取輔酶Q10的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了類球紅細(xì)菌輔酶Q10的最佳提取條件為：輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度OD為23.4，條件優(yōu)化后輔酶Q10單位細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)到11.86mg/L。

關(guān)鍵詞：類球紅細(xì)菌；輔酶Q10；單位細(xì)胞產(chǎn)量

中圖分類號 Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）06-23-03

輔酶Q10，又稱癸烯醌、泛醌（商品名：Coenzyme Q10，簡稱CoQ10），是一種存在于革蘭氏陰性細(xì)菌、植物細(xì)胞和動物肝臟中的脂溶性醌類化合物，是細(xì)胞呼吸傳遞鏈上的重要遞氫體[1]。輔酶Q10作為一種生理活性物質(zhì)，具有保健、改善作用，因此被廣泛應(yīng)用于藥業(yè)、化妝和食品產(chǎn)業(yè)[2]。輔酶Q10參與細(xì)胞的代謝活動，并且可以用來治療心臟病、高膽固醇、高血壓、老年癡呆癥、帕金森癥等疾病[3]。

目前制備生產(chǎn)輔酶Q10的方法有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和動植物組織提取法[4]，其中微生物發(fā)酵法被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的[5-7]，輔酶Q10存在菌體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上，屬于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物。所以輔酶Q10的提取和檢測首先涉及到如何充分地破壞細(xì)胞使其細(xì)胞內(nèi)的輔酶Q10盡量的釋放出來而被檢測。而輔酶Q10的側(cè)鏈存在著不飽和雙鍵，使輔酶Q10的在提取過程中容易受到氧化劑、紫外線等因素的影響，這是由于輔酶Q10的側(cè)鏈存在著不飽和雙鍵易受到這些因素影響而發(fā)生氧化和加成反應(yīng)，使其散失原有的生物活性，甚至?xí)纬蓪θ梭w有害的物質(zhì)，因此研究提取因素對輔酶Q10的影響具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

為了能夠得到和檢測輔酶Q10，首先必須對菌體進(jìn)行破壁，使其體內(nèi)輔酶Q10能夠釋放出來，而常見的細(xì)胞破壁方法有非機(jī)械法和機(jī)械法，本研究選擇了機(jī)械法中的超聲波破壁法，對超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間和菌液濃度條件進(jìn)行了優(yōu)化，以確定輔酶Q10的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株 Rhodobacter sphaeroate EIM，由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏。

1.2 主要試劑和儀器 無水乙醇、電熱恒溫水浴鍋（DK-80）、超聲波破碎儀（BIOMETRA）、高速冷凍離心機(jī)（AllegraTMX-22R Centrifuge）、超高效液相色譜儀（Acquity UPLC）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液的預(yù)處理 輔酶Q10是類維生素脂溶性物質(zhì)，且屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，因此提取輔酶Q10包括以下2步：進(jìn)行細(xì)胞的破碎和輔酶Q10的溶解分離。取5mL發(fā)酵液在8 000r/min的條件下離心10min，棄去上清液，無水乙醇洗滌1～2次，并用無水乙醇制成懸濁液，定容至20mL，利用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎細(xì)胞。

1.3.2 菌體干重的測定 發(fā)酵液經(jīng)過8 000r/min離心10min，去上清液并用蒸餾水洗滌后，放置100℃烘箱中烘干至恒重后稱量。

1.3.3 發(fā)酵液中輔酶Q10的測定 取1mL發(fā)酵液置于10mL的棕色容量瓶中，滴加20μL的6mol/L的HCl，加入1mL的丙酮，搖勻，加1mL的30%過氧化氫，搖勻，再加入無水乙醇2mL，搖勻，預(yù)超聲1min去除氣泡，最后用無水乙醇定容至10mL，超聲45min，超聲結(jié)束后搖勻靜止30min，用0.22μm的有機(jī)膜過濾即可得到輔酶Q10樣品，再用WATERS-Acquity UPLC進(jìn)行分析測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輸出功率對輔酶Q10提取的影響 用超聲波每次輻射/間歇時(shí)間為5s/6s、總工作時(shí)間為5min、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察超聲波輸出功率對輔酶Q10提取的影響（圖1）。

由圖1可知當(dāng)超聲波的輸出功率過小時(shí)，對菌體細(xì)胞的破碎程度不夠強(qiáng)烈，導(dǎo)致細(xì)胞不能被破碎，使細(xì)胞內(nèi)的輔酶Q10無法溶解在乙醇中。輸出功率的提高有利于液體中空穴的形成，從而形成更多的空化泡產(chǎn)生空化效應(yīng)，有利于細(xì)胞的破碎。當(dāng)繼續(xù)提高超聲波功率，發(fā)現(xiàn)超聲波輸出功率在55%時(shí)輔酶Q10提取量最高，但是超聲波輸出功率超過55%后，輔酶Q10提取量呈現(xiàn)下降趨勢，分析原因是超聲過程中產(chǎn)生的空化作用對細(xì)胞產(chǎn)生了局部的高溫高壓，使得溶液中產(chǎn)生了H·和OH·等自由基[8]，這些強(qiáng)氧化性的自由基會氧化和降解溶液中的輔酶Q10，從而使輔酶Q10提取量下降。因而確定超聲波的最佳輸出功率為55%。

2.2 超聲波每次輻射時(shí)間對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、總工作時(shí)間為5min、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察超聲波每次輻射時(shí)間對輔酶Q10提取的影響（圖2）。

結(jié)果表明，在超聲條件相同的情況下，每次輻射時(shí)間為4s效果最好，此時(shí)提取的輔酶Q10量最高。超聲波破碎細(xì)胞的過程：超聲波使溶液形成空穴，從而產(chǎn)生空化泡，然后再由空化泡進(jìn)行震動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程，這一過程由短暫的時(shí)間來完成的，短時(shí)多次的工作方式有利于超聲波產(chǎn)生更多的空化泡，有更多的機(jī)會完成膨脹和爆炸的過程，因此有利于細(xì)胞的破碎[9]。不過當(dāng)每次輻射時(shí)間過短時(shí)，輔酶Q10提取量反而下降，這可能是由于輻射時(shí)間過短導(dǎo)致超聲波空化作用起不到對細(xì)胞爆裂破壁作用所致。當(dāng)每次輻射時(shí)間達(dá)到4s時(shí)，輔酶Q10提取量最大，當(dāng)繼續(xù)提高每次輻射時(shí)間輔酶Q10提取量卻下降了，這可能是由于輻射時(shí)間越長使得超聲波產(chǎn)生的空化作用越強(qiáng)，導(dǎo)致產(chǎn)生的活性氧也越多，輔酶Q10被氧化降解，提取量下降。因此，選擇4s作為超聲波的最佳輻射時(shí)間。

2.3 超聲波工作總時(shí)間對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時(shí)間為4s/6s、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察超聲波工作總時(shí)間對輔酶Q10提取的影響（圖3）。

在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時(shí)間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時(shí)間充分，細(xì)胞破碎充分，輔酶Q10從細(xì)胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時(shí)間進(jìn)一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時(shí)間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當(dāng)提高工作總時(shí)間可以提高輔酶Q10提取量，但時(shí)間不宜過長，最佳總工作時(shí)間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時(shí)間為4s/6s、工作總時(shí)間為4min，對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當(dāng)菌液濃度很稀時(shí)，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細(xì)胞效果也很差，隨著菌液濃度的進(jìn)一步提高，超聲波傳遞過程的能量進(jìn)一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時(shí)，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗(yàn)確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個(gè)因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時(shí)間>每次輻射時(shí)間>菌液濃度，綜合各個(gè)因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達(dá)到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細(xì)胞過程要在冰浴條件下進(jìn)行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應(yīng)該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

參考文獻(xiàn)

[1]Lenaz G，F(xiàn)ato R，F(xiàn)ormiggini G，et a1.The role of coenzyme Q in mitochondrial electron transport[J].Mitochondrion，2007，7：8-33.

[2]Kawamukai M.Biosynthesis，bioproduction and novel roles of ubiquinone[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94（6）：511-517.

[3]Wyman M， Leonard M，Morledge T.Coenzyme Q10：a therapy for hypertension and statin-induced myalgia[J].Cleveland Clinic journal of medicine，2010，77（7）：435-442.

[4]李英華.煙草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)輔酶Q10 的研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

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[6]吳祖芳，翁佩芳，陳堅(jiān).輔酶Q10 的功能研究進(jìn)展[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2001（2）：85-88.

[7]趙樹全，劉悅才，江國托.釀酒酵母菌體中輔酶Q10 的提取及測定方法[J].釀酒科技，2008（11）：114-116.

[8]歐陽琴，陳興才，黃亞治.雨生紅球藻提取蝦青素不同機(jī)械破壁方法的研究[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，33（1）：111-115.

[9]吳克剛，楊連生，黃通旺.超聲波破碎Thraustochyt rium 提取脂質(zhì)的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22（4）：31-34.

[10]傅紹軍，李微，朱利民.瑞士乳酸桿菌搖瓶發(fā)酵條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].藥物生物技術(shù)，2005（6）：361-365. （責(zé)編：施婷婷）

在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時(shí)間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時(shí)間充分，細(xì)胞破碎充分，輔酶Q10從細(xì)胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時(shí)間進(jìn)一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時(shí)間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當(dāng)提高工作總時(shí)間可以提高輔酶Q10提取量，但時(shí)間不宜過長，最佳總工作時(shí)間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時(shí)間為4s/6s、工作總時(shí)間為4min，對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當(dāng)菌液濃度很稀時(shí)，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細(xì)胞效果也很差，隨著菌液濃度的進(jìn)一步提高，超聲波傳遞過程的能量進(jìn)一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時(shí)，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗(yàn)確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個(gè)因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時(shí)間>每次輻射時(shí)間>菌液濃度，綜合各個(gè)因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達(dá)到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細(xì)胞過程要在冰浴條件下進(jìn)行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應(yīng)該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

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[10]傅紹軍，李微，朱利民.瑞士乳酸桿菌搖瓶發(fā)酵條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].藥物生物技術(shù)，2005（6）：361-365. （責(zé)編：施婷婷）

在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時(shí)間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時(shí)間充分，細(xì)胞破碎充分，輔酶Q10從細(xì)胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時(shí)間進(jìn)一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時(shí)間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當(dāng)提高工作總時(shí)間可以提高輔酶Q10提取量，但時(shí)間不宜過長，最佳總工作時(shí)間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時(shí)間為4s/6s、工作總時(shí)間為4min，對處理后的發(fā)酵液進(jìn)行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當(dāng)菌液濃度很稀時(shí)，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細(xì)胞效果也很差，隨著菌液濃度的進(jìn)一步提高，超聲波傳遞過程的能量進(jìn)一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時(shí)，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗(yàn)確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時(shí)間、工作總時(shí)間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個(gè)因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時(shí)間>每次輻射時(shí)間>菌液濃度，綜合各個(gè)因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達(dá)到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時(shí)間為3s、工作總時(shí)間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細(xì)胞過程要在冰浴條件下進(jìn)行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應(yīng)該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

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