內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞凋亡

季英磊，閆駿，王艷莎，劉夷嫦，谷振勇

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇南通226001）

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的急性肝損傷是創(chuàng)傷性多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）發(fā)病的早期重要環(huán)節(jié)[1]。多種肝病的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]，創(chuàng)傷應(yīng)激引起腸黏膜屏障功能異常、腸道細(xì)菌移位、內(nèi)毒素入血是導(dǎo)致急性肝損傷的關(guān)鍵發(fā)病途徑[3]。本研究應(yīng)用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）[4]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）[5]處理肝細(xì)胞，觀察肝細(xì)胞活力及凋亡變化并檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白表達(dá)變化，初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用，為探索創(chuàng)傷性MODS急性肝損傷的相關(guān)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

LPS、TG、4-PBA、二甲基亞砜（dmethyl sulfoxide，DMSO）、ECL熒光檢測(cè)試劑盒（美國Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（美國Invitrogen公司），胎牛血清（美國Thermo Scientific公司），細(xì)胞裂解液（美國Fermentas Life Sciences公司），MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Hoechst染色試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），GRP78、CHOP、caspase-12兔多克隆抗體、激活型caspase-3（c-caspase-3）小鼠單克隆抗體，辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗小鼠，抗兔IgG（美國Santa Cruz公司），β-tubulin小鼠單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Syn-H4型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），BX51型熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），F(xiàn)C500型流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司），5430R型高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司），GelDOC型凝膠電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

正常大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。BRL細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL、鏈霉素100U/mL），置于37℃、5%CO23111型培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為觀察LPS的時(shí)效和量效關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)分別給予10μg/mL LPS處理BRL細(xì)胞4、8、12、24h，以及0.1、1、10、100 μg/mL LPS處理BRL細(xì)胞12 h，以PBS溶劑作為空白對(duì)照，每組重復(fù)3次。

為觀察LPS誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間的因果關(guān)系，實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組、LPS組、LPS+TG組、LPS+4-PBA組，分別給予溶劑、2 μmol/L TG、5 mmol/L 4-PBA、10 μg/mL LPS、10 μg/mL LPS和2 μmol/L TG、10 μg/mL LPS和5 mmol/L 4-PBA，均處理細(xì)胞12h，每組重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞活力的檢測(cè)

用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力[6]。取對(duì)數(shù)生長期的肝細(xì)胞，以2×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于96孔板內(nèi)，每孔200μL，37℃、5%CO2條件下孵育過夜，更換培養(yǎng)液，按前述分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)要求時(shí)間，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL、混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL振蕩使沉淀充分溶解，酶標(biāo)儀在490nm波長測(cè)定吸光度值（OD值）。用OD值反映細(xì)胞活力，OD值越大細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.4 細(xì)胞凋亡的確證實(shí)驗(yàn)

Hoechst 33258染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞核形態(tài)以確證細(xì)胞凋亡[7]。取對(duì)數(shù)生長期的肝細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，按前述分組方法處理細(xì)胞至適當(dāng)時(shí)間，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4℃固定細(xì)胞10 min，加入5 mg/L Hoechst 33258染色液作用10min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察、攝片。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密的固縮狀強(qiáng)熒光或顆粒狀熒光[8]。

1.5 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率[9]。取對(duì)數(shù)生長期的肝細(xì)胞按前述分組方法處理細(xì)胞，PBS洗滌，加入適量胰酶消化細(xì)胞，棄去胰酶，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。主要步驟為：取1×105個(gè)細(xì)胞，1 000×g離心5min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5μL PI，混勻室溫避光放置15min，再加入300μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.6 Western印跡法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的BRL細(xì)胞按前述分組方法處理細(xì)胞，PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液（每100 μL中加入1μL蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞約10min，收集細(xì)胞至微量離心管中，12 000×g，4℃高速離心15 min后，留取上清液進(jìn)行蛋白定量（Bradford法）。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小選用不同濃度的SDS-PAGE，取30μg蛋白上樣量，濃縮膠80V 20min，分離膠110V，當(dāng)電泳前端溴酚藍(lán)行進(jìn)至分離膠下緣時(shí)，停止電泳。采用半干式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，15V 1h。然后用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2h，分別加1∶200稀釋的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白CHOP、caspase-12和c-caspase-3一抗4℃孵育過夜，TBS洗滌3次，每次10min，再分別加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-tubulin為內(nèi)參照。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并用Quantity One圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的光密度比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞活力的變化

溶劑對(duì)照組不同時(shí)間肝細(xì)胞活力未見明顯變化，LPS時(shí)間依賴性和濃度依賴性引起肝細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），其中10 μg/mL LPS處理12 h細(xì)胞活力約為溶劑對(duì)照組的40%（表1~2）。TG處理12h可引起肝細(xì)胞活力明顯降低，為溶劑對(duì)照組的79%（P＜0.05）。LPS+TG處理12h引起了肝細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，為溶劑對(duì)照組的15%（P＜0.05），并低于LPS單獨(dú)處理引起的細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。4-PBA處理12h對(duì)肝細(xì)胞活力影響不大，但LPS+4-PBA處理12h可部分逆轉(zhuǎn)LPS引起的細(xì)胞活力降低（P＜0.05），見表3。

表1 LPS時(shí)間依賴性引起肝細(xì)胞活力變化（OD值）（n=3，±s）

表1 LPS時(shí)間依賴性引起肝細(xì)胞活力變化（OD值）（n=3，±s）

注：1）與相同時(shí)間點(diǎn)溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別4h8h12h24h溶劑對(duì)照0.652±0.0410.665±0.0350.657±0.0370.648±0.041 10μg/mL LPS0.581±0.0290.595±0.0280.275±0.0311）0.084±0.0301）

表2 LPS濃度依賴性引起肝細(xì)胞活力變化（n=3，±s）

表2 LPS濃度依賴性引起肝細(xì)胞活力變化（n=3，±s）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別OD值溶劑對(duì)照0.712±0.035 0.1μg/mL0.688±0.027 1.0μg/mL0.612±0.032 10μg/mL0.275±0.0341）100μg/mL0.114±0.0241）

表3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS引起肝細(xì)胞活力變化中的作用（n=3，±s）

表3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS引起肝細(xì)胞活力變化中的作用（n=3，±s）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與LPS組比較，P＜0.05

組別OD值溶劑對(duì)照0.682±0.037 TG0.542±0.0281）4-PBA0.701±0.040 LPS0.275±0.0311）LPS+TG0.103±0.0341）2）LPS+4-PBA0.434±0.0351）2）

2.2 肝細(xì)胞凋亡的核形態(tài)變化

溶劑對(duì)照組肝細(xì)胞核熒光染色均勻；TG、LPS、LPS+TG和LPS+4-PBA處理后可見肝細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞核特征變化，如細(xì)胞核濃縮、聚集，細(xì)胞核呈致密濃染熒光；4-PBA處理后偶見肝細(xì)胞顯示細(xì)胞凋亡核特征變化。

2.3 肝細(xì)胞凋亡率的變化

LPS能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡明顯增多，且具有濃度和時(shí)間依賴性（P＜0.05，表4~5），其中LPS處理12h時(shí)肝細(xì)胞凋亡率約為50%，高于溶劑對(duì)照組（P＜0.05，圖1~2）；TG處理12h時(shí)肝細(xì)胞凋亡率為29.4%，高于對(duì)照組（P＜0.05），而LPS+TG處理12h時(shí)肝細(xì)胞凋亡率明顯增高，為55.1%（P＜0.05）。4-PBA處理12h時(shí)肝細(xì)胞凋亡率僅為9.7%（P＜0.05），LPS+4-PBA處理12 h能翻轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡率增高，肝細(xì)胞凋亡率降低為30.6%（P＜0.05，表6、圖3）。

表4 LPS時(shí)間依賴性引起肝細(xì)胞凋亡率變化（n=3，±s，%）

表4 LPS時(shí)間依賴性引起肝細(xì)胞凋亡率變化（n=3，±s，%）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別細(xì)胞凋亡率溶劑對(duì)照0.7±0.5 4h8.1±2.11）8h39.4±5.01）12h50.1±2.61）24h60.9±7.91）

表5 LPS濃度依賴性引起肝細(xì)胞凋亡率變化（n=3，±s，%）

表5 LPS濃度依賴性引起肝細(xì)胞凋亡率變化（n=3，±s，%）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別細(xì)胞凋亡率溶劑對(duì)照0.7±0.6 0.1μg/mL35.6±0.51）1.0μg/mL46.2±4.01）10μg/mL50.0±2.61）100μg/mL57.1±3.11）

表6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS引起肝細(xì)胞凋亡率變化中的作用（n=3，±s，%）

表6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS引起肝細(xì)胞凋亡率變化中的作用（n=3，±s，%）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與LPS組比較，P＜0.05

組別細(xì)胞凋亡率溶劑對(duì)照1.6±0.8 TG29.4±4.31）4-PBA9.7±1.91）LPS49.6±2.01）LPS+TG55.1±1.11）2）LPS+4-PBA30.6±4.21）2）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞時(shí)間依賴性凋亡率變化

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞濃度依賴性凋亡率變化

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LPS聯(lián)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)試劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡率變化

2.4 GRP78、CHOP、caspase-12和c-caspase-3的表達(dá)變化（表7～8，圖4）

與溶劑對(duì)照組比較，10μg/mL LPS處理4～24 h，肝細(xì)胞GRP78蛋白呈時(shí)間依賴性表達(dá)，其中8、12 h時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），在24 h時(shí)表達(dá)略微下降（P＜0.05）；0.1、1.0、10、100μg/mL LPS處理12h，肝細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)（P＜0.05）。

10 μg/mL LPS處理4～24 h，肝細(xì)胞CHOP、caspase-12蛋白呈時(shí)間依賴性表達(dá)上調(diào)，與溶劑對(duì)照組相比，8、12、24h時(shí)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.1、1.0、10、100μg/mL LPS處理12h，肝細(xì)胞CHOP、caspase-12蛋白呈濃度依賴性表達(dá)上調(diào)，與溶劑對(duì)照組相比1.0、10、100μg/mL LPS處理組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

10 μg/mL LPS處理4～24 h，肝細(xì)胞c-caspase-3蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)，其中在8～24 h明顯上調(diào)（P＜0.05）；0.1、1.0、10、100 μg/mL LPS處理12 h，肝細(xì)胞c-caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，與溶劑對(duì)照組相比，10、100 μg/mL LPS處理組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表7 LPS時(shí)間依賴性引起GRP78、CHOP、caspase-12、c-caspase-3的表達(dá)變化（n=3，±s）

表7 LPS時(shí)間依賴性引起GRP78、CHOP、caspase-12、c-caspase-3的表達(dá)變化（n=3，±s）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別GRP78CHOPcaspase-12c-caspase-3溶劑對(duì)照0.110±0.0200.050±0.0070.080±0.0090.004±0.001 4h0.190±0.0200.090±0.0040.130±0.0070.005±0.001 8h0.300±0.0101）0.140±0.0051）0.290±0.0051）0.182±0.0051）12h0.390±0.0201）0.210±0.0031）0.360±0.0071）0.254±0.0031）24h0.320±0.0301）0.320±0.0041）0.390±0.0061）0.261±0.0071）

表8 LPS濃度依賴性引起GRP78、CHOP、caspase-12、c-caspase-3的表達(dá)變化（n=3，±s）

表8 LPS濃度依賴性引起GRP78、CHOP、caspase-12、c-caspase-3的表達(dá)變化（n=3，±s）

注：1）與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05

組別GRP78CHOPcaspase-12c-caspase-3溶劑對(duì)照0.120±0.0200.049±0.0070.084±0.0090.004±0.001 0.1μg/mL0.190±0.0100.078±0.0050.115±0.0060.008±0.001 1.0μg/mL0.230±0.0201）0.109±0.0071）0.189±0.0071）0.019±0.005 10μg/mL0.310±0.0301）0.251±0.0041）0.317±0.0061）0.252±0.0051）100μg/mL0.370±0.0101）0.374±0.0061）0.443±0.0051）0.266±0.0041）

圖4 LPS引起大鼠肝細(xì)胞GRP78、caspase-12、CHOP、c-caspase-3表達(dá)變化的電泳圖

3 討論

創(chuàng)傷性MODS是具有明顯法醫(yī)學(xué)特色的綜合性病理過程，其死亡性質(zhì)屬于外力作用引起的暴力性死亡，但由于死亡發(fā)生的主要機(jī)制為外傷激活的體內(nèi)病理過程，其致命性病理學(xué)變化為非特征性的，并且創(chuàng)傷性MODS引起的死亡并非發(fā)生于所受外傷當(dāng)時(shí)，往往接受了臨床搶救后原發(fā)性外傷發(fā)生了變化或某些外傷貌似輕微如大面積軟組織挫壓傷，這些特點(diǎn)導(dǎo)致對(duì)判斷相關(guān)案件受害人的死亡性質(zhì)出現(xiàn)困難。因此，研究創(chuàng)傷性MODS的發(fā)生機(jī)制一直是法醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。探討創(chuàng)傷性MODS的病理生理過程可以把原發(fā)性外傷與非特異性病理變化聯(lián)系起來，成為構(gòu)建法醫(yī)學(xué)診斷創(chuàng)傷性MODS標(biāo)準(zhǔn)體系的有機(jī)組成部分。研究[10]表明，大面積軟組織外傷可以導(dǎo)致急性肝損傷；創(chuàng)傷應(yīng)激引起的腸源性LPS入血是急性肝損傷的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)主要發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，LPS和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG均能導(dǎo)致肝細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡增加，TG加重而4-PBA減輕LPS引起的肝細(xì)胞損傷，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與介導(dǎo)了LPS引起的肝細(xì)胞損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為細(xì)胞蛋白質(zhì)分子合成、折疊修飾以及脂質(zhì)合成、Ca2+儲(chǔ)存的場(chǎng)所，也是感受細(xì)胞應(yīng)激的重要細(xì)胞器[11]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能正常時(shí)，分子伴侶GRP78主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜并與IRE1α、PERK和ATF6等處于結(jié)合狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)分子增多亦即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與前述3種蛋白質(zhì)分子解離并且蛋白表達(dá)上調(diào)、以結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)分子。因此，GRP78表達(dá)量的變化成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志[12]。以往報(bào)道[3]，病毒性肝炎、脂肪代謝異常均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS引起了肝細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并呈現(xiàn)時(shí)效和量效關(guān)系，表明LPS引起了肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。LPS引起肝細(xì)胞活力明顯降低和細(xì)胞凋亡明顯增多，說明LPS可造成肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡可能是LPS引起肝細(xì)胞損傷的主要形式，這與以往報(bào)道[13-14]一致。為了查明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LPS引起肝細(xì)胞損傷中的作用，實(shí)驗(yàn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG和抑制劑4-PBA分別處理肝細(xì)胞。結(jié)果顯示，TG也能引起肝細(xì)胞活力明顯降低、細(xì)胞凋亡明顯增多，這與LPS的作用類似但程度明顯輕微；4-PBA對(duì)細(xì)胞活力影響不大而引起細(xì)胞凋亡，凋亡率為9.7%。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的重要發(fā)生機(jī)制，LPS引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能介導(dǎo)了LPS引起的肝細(xì)胞損傷，4-PBA引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。同樣劑量的TG和LPS共同作用引起肝細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞凋亡明顯增高，與TG和LPS單獨(dú)作用相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而4-PBA部分翻轉(zhuǎn)了LPS對(duì)肝細(xì)胞的損傷效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)LPS引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與介導(dǎo)了LPS引起的肝細(xì)胞損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是LPS導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的重要發(fā)病途徑。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)LPS引起肝細(xì)胞凋亡的上游信號(hào)途徑。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生過程中，與GRP78解離的IRE1α、PERK和ATF6分別發(fā)生磷酸化修飾、激活，并啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)或非折疊蛋白反應(yīng)，分別激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)細(xì)胞功能和代謝等予以調(diào)整、適應(yīng)從而發(fā)揮細(xì)胞代償反應(yīng)和保護(hù)作用。只有當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于嚴(yán)重或處于持續(xù)狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞即啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞死亡途徑、引發(fā)細(xì)胞死亡[15]。這是近年來發(fā)現(xiàn)的、一種新穎的細(xì)胞凋亡途徑。CHOP和caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白分子。在正常細(xì)胞中CHOP表達(dá)水平十分低下；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，非折疊蛋白反應(yīng)的效應(yīng)分子IRE1α、PERK和ATF6活化后均可誘導(dǎo)CHOP表達(dá)上調(diào)[16]。caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因子，屬于蛋白質(zhì)水解酶caspases家族成員，正常情況下以蛋白酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上[17]，caspase-12活化后可通過激活caspase-9和caspase-3等效應(yīng)分子，獨(dú)立誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而不需依賴于細(xì)胞凋亡的死亡受體和線粒體途徑[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS引起肝細(xì)胞CHOP、caspase-12和c-caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，并呈現(xiàn)量效和時(shí)效關(guān)系，綜合前述細(xì)胞凋亡結(jié)果，提示LPS不僅誘導(dǎo)了肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)，CHOP、caspase-12和c-caspase-3途徑可能是LPS誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加的信號(hào)途徑。值得注意的是，10μg/mL LPS引起肝細(xì)胞活力降低在12h開始明顯降低、肝細(xì)胞凋亡則在4~24 h呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增高，而GRP78、CHOP、caspase-12和c-caspase-3均在8h表達(dá)明顯上調(diào)，這提示LPS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑可能介導(dǎo)了LPS作用8h后肝細(xì)胞損傷，而與早期的肝細(xì)胞凋亡關(guān)系不大。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS引起肝細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑參與介導(dǎo)了LPS引起的肝細(xì)胞凋亡，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的重要發(fā)病途徑，有助于加深對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致創(chuàng)傷性MODS急性肝損傷發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

（本實(shí)驗(yàn)得到了南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院金國華教授和沈之君教授的大力支持，在此表示感謝?。?/p>

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