動物內(nèi)源性多肽CGA-N46對念珠菌細胞增殖的影響

閻曉慧 李瑞芳 張慧茹 尹艷杰 盧研博 盧亞麗

（河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450001）

動物內(nèi)源性多肽CGA-N46對念珠菌細胞增殖的影響

閻曉慧 李瑞芳 張慧茹 尹艷杰 盧研博 盧亞麗

（河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450001）

CGA-N46是人嗜鉻粒蛋白N端具有抗真菌活性的多肽片段。采用MTT法檢測CGA-N46對克柔念珠菌生長的抑制作用，以β-1，3-葡聚糖酶活性檢測克柔念珠菌細胞壁的完整性，采用PI檢測克柔念珠菌細胞膜通透性，用羅丹明123檢測線粒體膜電位。試驗結(jié)果證實，0.5 mg/mL的CGA-N46能夠明顯抑制克柔念珠菌的細胞增殖能力；對其細胞壁的完整性及細胞膜的通透性沒有影響；CGA-N46能明顯降低線粒體膜電位。推測CGA-N46可能通過影響線粒體膜電位來抑制克柔念珠菌的生長。

CGA-N46 克柔念珠菌 抑菌作用 線粒體膜電位

動物內(nèi)源性多肽作為存在于動物機體的非特異性免疫因子，對識別、抵抗和殺滅入侵動物機體的有害微生物，維持動物健康有重要作用。動物內(nèi)源性多肽在快速殺菌的同時，還具有不易產(chǎn)生耐藥性、生物安全性高及中和內(nèi)毒素等特性，目前已成為世界抗菌領域的研究重點，應用前景廣闊［1-3］。

近年來，侵染性真菌感染的發(fā)病率及死亡率不斷升高。侵染性真菌感染主要由念珠菌引起，其中白色念珠菌感染較為突出，但由于唑類抗真菌藥物的使用，使白色念珠菌的感染趨勢下降，而對氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌的感染呈升高趨勢［4］?？巳崮钪榫亩玖﹄m稍弱于白色念珠菌，但其憑著強大的黏附力，附著人體表面并繁殖，引起口腔、肺部、陰道及全身多系統(tǒng)感染，從而嚴重威脅患者生命［5，6］。

嗜鉻粒蛋白Chromogranin A（以下簡稱CGA）普遍存在于動物內(nèi)分泌細胞和神經(jīng)細胞中，由439個氨基酸組成，CGA中有保守的蛋白酶切位點，能夠被水解為具有不同生物功能的多肽片段［7］。前期研究克隆了CGA N端的不同基因片段，通過測定其抗菌活性，證實位于CGA N端31-76位氨基酸組成的CGA-N46具有較強的抗真菌活性［8］；抗菌譜試驗表明CGA-N46可抑制多種致病真菌的增殖并誘導其細胞死亡，特別是對克柔念珠菌抑菌活性最強［9］，但其具體作用機制尚不清楚。

目前研究認為，大部分抗菌肽的抑菌機制是膜結(jié)構(gòu)破壞型，如抗菌肽Protegrin能以多聚體的形式結(jié)合在細胞膜上，在細胞膜上形成孔道使細胞內(nèi)鉀離子滲漏導致細胞死亡［10］。少數(shù)抗菌肽能在不破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的情況下透過膜，與胞內(nèi)細胞器和大分子相互作用，廣泛影響胞內(nèi)核酸合成與修復、蛋白質(zhì)合成、細胞壁與隔膜合成等生理活動，從而發(fā)揮殺菌抑菌作用。如細菌素Lcn972主要通過與細胞壁前體特異性結(jié)合，從而阻礙細胞分裂［11］。本試驗通過研究CGA-N46對克柔念珠菌細胞壁、細胞膜及線粒體膜電位的作用，旨在闡明CGA-N46的作用機理，為其作為抗真菌藥物研究的靶標提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

克柔念珠菌：鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科惠贈。噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、羅丹明123（Rh-123）、昆布多糖均購自美國Sigma公司，Triton X-100購自華美生物工程有限公司，其它化學試劑為分析純。沙保氏（SDA）液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46對克柔念珠菌的抑制率 將克柔念珠菌接種于SDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對數(shù)期。參照文獻［12］方法并加以改進。將CGA-N46分別以不同濃度0、0.5、1、2、4、8 mg/mL加入含克柔念珠菌細胞（106個細胞/孔）的96孔板中，每個濃度設4個重復，同時設不含細胞外、其他條件相同的空白對照。孵育3 h后，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩孵育20 min，至顆粒完全溶解，酶標儀上測定570 nm處的吸光度（A），以下列公式計算抑制率。

細胞抑制率（%）=［1-（加藥組A值-空白組A值）/（零濃度組A值-空白組A值）］×100% 1.2.2 β-1，3-葡聚糖酶活測定 采用還原法測定β-1，3-葡聚糖酶液與CGA-N46混合物的酶活性。將β-1， 3-葡聚糖酶液與0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46 孵育30 min，加入昆布多糖進行還原反應，設蒸餾水為空白對照，檢測550 nm 處的吸光光度值（A）。每個濃度做3個重復，取平均值，記為OD550；與不加CGA-N46反應混合物進行比較，差值記A550 nm。根據(jù)葡萄糖標準曲線，將2組OD550差值折算成還原糖量。定義一個酶活單位（U）為每分鐘生成相當于1 μg葡萄糖的還原糖所需的酶量。根據(jù)酶活單位計算不同濃度CGA-N46對β-1，3-葡聚糖酶活力的影響。

1.2.3 細胞膜通透性測定 取106CFU/mL克柔念珠菌與0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46作用3 h，收集菌體沉淀，20 mmoL/L pH6.0 的磷酸鈉緩沖液沖洗菌體沉淀2次，重懸后，加入PI（終濃度為50 μg/mL），室溫、避光作用10 min以上，在488 nm激發(fā)光下觀察熒光強度。以不添加CGA-N46組、加入 PI的同時加入Triton X-100（終濃度為0.3%）作為陽性對照。

1.2.4 線粒體膜電位測定 將克柔念珠菌接種于SDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌體終濃度為107CFU/mL，與不同濃度（0、1、2、4、8 mg/mL）CGA-N46作用3 h后，離心，取菌體沉淀，用PBS重懸菌體沉淀為相同濃度的菌懸液。每個樣品中加入1 μL Rh-123溶液（終濃度10 μg/mL），避光條件下靜置作用30 min，PBS洗滌1次。取20 μL制片，熒光顯微鏡下，藍光區(qū)進行觀察。根據(jù)熒光強度判斷線粒體膜電位變化情況。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS18.0 軟件進行組間方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CGA-N46對克柔念珠菌的抑制作用

對數(shù)生長期的克柔念珠菌細胞經(jīng)不同濃度CGAN46處理3 h，MTT檢測CGA-N46對克柔念珠菌的抑制作用（表1）。

由表1可知，當CGA-N46濃度為0.5 mg/mL時，細胞抑制率為41.11%；當CGA-N46濃度增至8 mg/mL時，其細胞抑制率就增加至85.00%。由此可見，CGA-N46能使克柔念珠菌細胞的生長明顯受到抑制，且對克柔念珠菌細胞抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性升高。

2.2 CGA-N46對細胞壁的影響

通過測定β-1，3-葡聚糖酶活性檢測細胞壁的完整性。CGA-N46對β-1，3-葡聚糖酶活性的影響如圖所示（圖1），沒有經(jīng)過CGA-N46處理的β-1，3-葡聚糖酶的活性為21.986。當CGA-N46濃度為1、2、4、8 mg/mL 時，反應混合物中β-1，3-葡聚糖酶的活性沒有顯著變化，分別為22.114、22.144、22.015和22.085。說明CGA-N46對β-1，3-葡聚糖酶活性沒有明顯影響，也即細胞壁的完整性不受CGA-N46的影響。

2.3 CGA-N46對克柔念珠菌細胞膜通透性的影響

將不同濃度CGA-N46與克柔念珠菌作用3 h后，PI熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。陽性對照Triton X-100處理則出現(xiàn)紅色熒光，而經(jīng)不同濃度CGA-N46處理克柔念珠菌3 h后，克柔念珠菌內(nèi)沒有明顯的熒光，說明CGA-N46不能破壞克柔念珠菌細胞膜的通透性。

2.4 CGA-N46對克柔念珠菌細胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

將不同濃度CGA-N46與克柔念珠菌作用3 h后，用Rh-123熒光探針標記CGA-N46處理過的克柔念珠菌細胞，以檢測線粒體膜電位的變化。如圖3所示，經(jīng)0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46處理3 h后，對克柔念珠菌進行Rh-123染色發(fā)現(xiàn)，隨著CGA-N46濃度的逐漸升高，熒光強度高的克柔念珠菌細胞明顯減少，說明CGA-N46能明顯降低其線粒體膜電位。

3 討論

MTT常用來檢測細胞存活和生長，是線粒體呼吸鏈氧化還原酶狀態(tài)的指示劑，活細胞線粒體內(nèi)激活態(tài)的氧化還原酶能使外源性MTT還原為極其難溶的藍紫色結(jié)晶物并沉積于細胞內(nèi)，但是死細胞無此作用，故吸光度A值可間接反映細胞內(nèi)酶的活性及活細胞的數(shù)量［13］。本試驗通過MTT法觀察到，不同濃度（0-8 mg/mL）CGA-N46 作用于克柔念珠菌3 h后，對克柔念珠菌細胞抑制率明顯升高，且呈一定的濃度依賴性。這說明CGA-N46降低了菌體細胞線粒體氧化還原酶活性，達到抑菌作用，從而導致菌體細胞活性下降。

β-1，3-葡聚糖是多種真菌細胞壁的構(gòu)成成分，對細胞壁的完整性以及維持細胞滲透壓穩(wěn)定起著重要作用。β-1，3-葡聚糖在真菌的生長發(fā)育過程中具有特殊的重要性，可以作為研究細胞壁完整性的評價指標。房舒等［14］在研究蛇床子素結(jié)構(gòu)修飾物JS-B對辣椒疫霉病菌抑菌作用機制中發(fā)現(xiàn)，JS-B能顯著降低辣椒疫霉菌絲中β-1，3-葡聚糖酶活性，可通過影響β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑制辣椒疫霉病菌生長。經(jīng)CGA-N46處理后，β-1，3-葡聚糖酶活性沒有明顯改變，說明CGA-N46 可能不是通過抑制克柔念珠菌β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑菌作用。

電鏡觀察可以準確地反映細胞的形態(tài)但不能精確地反映細胞膜通透性的變化，而紫外分光光度法由于胞內(nèi)蛋白及核酸泄漏量很低，影響測定結(jié)果的準確性，因此，該方法的精確度和靈敏度都不理想［15］。熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強、樣品用量少、方法簡便等優(yōu)點，通過熒光探針PI檢測CGA-N46處理后細胞內(nèi)熒光強度的變化，可以精確地表達細胞膜通透性的變化。細胞膜受損主要表現(xiàn)為細胞膜通透性增加，而 PI 不能透過完整的細胞膜，當細胞膜受到損傷后才可進入細胞內(nèi)部與核酸結(jié)合發(fā)出熒光。Zendo等［16］對乳球菌屬抗菌肽nisinA進行研究發(fā)現(xiàn)，nisin A的N端和細胞膜上的LipidⅡ形成膠束復合物，C端插入細胞膜中，在細胞膜上產(chǎn)生空洞，改變了細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)離子和ATP外泄后死亡。克柔念珠菌經(jīng)不同濃度CGAN46處理3 h后仍未發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)熒光強度增加或很少被染色，說明CGA-N46不能破壞克柔念珠菌細胞膜的通透性。

線粒體膜電位下降是細胞死亡級聯(lián)反應中發(fā)生較早的事件。一旦線粒體膜電位降低，細胞就會進入不可逆的凋亡過程，啟動凋亡［17］。當線粒體膜電位下降，線粒體的形態(tài)和功能就發(fā)生了改變。線粒體熒光探針Rh-123 能特異性地與活細胞線粒體結(jié)合指示細胞生活代謝狀態(tài)。在各種刺激下，線粒體Rh-123 熒光強度檢測，可代表線粒體數(shù)量和線粒體功能狀態(tài)。Rh-123熒光強度下降，說明線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電位差下降，不能提供足夠的電位梯度使標記物被吸收和保留在線粒體內(nèi)；電位差越小，線粒體吸收的染料越少，熒光強度就越弱［18］。本試驗采用Rh-123與克柔念珠菌細胞內(nèi)線粒體基質(zhì)結(jié)合，對線粒體進行標記，并采用熒光顯微鏡系統(tǒng)檢測活細胞內(nèi)的熒光強度，進行定性分析，以此反映菌體細胞內(nèi)線粒體膜電位的相對變化。試驗結(jié)果表明，空白對照組克柔念珠菌細胞內(nèi)Rh-123熒光強度最強，隨著CGA-N46濃度的增強，細胞內(nèi)Rh-123 熒光強度逐漸減弱。提示CGA-N46可能通過降低線粒體膜電位從而抑制克柔念珠菌增殖并誘導其細胞凋亡。這一研究結(jié)果和Fatma 等［19］的研究相同，他們發(fā)現(xiàn)真菌毒素AME能誘導人和動物細胞線粒體膜電位降低，激活線粒體凋亡通道致使人和動物細胞的存活能力降低，甚至死亡。

4 結(jié)論

CGA-N46對克柔念珠菌細胞壁的完整性和細胞膜的通透性沒有影響，可能通過降低克柔念珠菌線粒體膜電位抑制細胞的增殖作用。在這一過程中，CGA-N46是否通過降低線粒體膜電位來誘發(fā)線粒體途徑的細胞凋亡，還需要進一步研究。

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（責任編輯 李楠）

Effect of Animal Endogenous Polypeptide CGA-N46 on Cell Proliferation of Candidas

Yan Xiaohui Li Ruifang Zhang Huiru Yin Yanjie Lu Yanbo Lu Yali
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

CGA-N46 is an N terminal derived peptide of human Chromogranin A (CGA) that has anti-fungal activities. The growth inhibition effect onCandida kruseiwas measured with MTT assay. The cell wall integrity ofCandida kruseiwas examined by monitoring β-1,3-glucanase activity. The effect of CGA-N46 on the permeability ofCandida kruseimembrane was examined using Propidium iodide detection. The effect of CGA-N46 on mitochondrial membrane potential was evaluated through Rh-123 assay. The results of showed 0.5 mg/mL CGA-N46 could significantly inhibit the proliferation of theC. kruseicells. CGA-N46 had no obvious effect on the β -1, 3-glucanase activity. There was no significant influence on the permeability ofC. kruseicell membrane; CGA-N46 could significantly decrease the mitochondrial membrane potential. A conclusion can therefore be made that CGA-N46 may inhibit the growth of Candidas by affecting the mitochondrial membrane potential.

CGA-N46Candida kruseiInhibitory effect Mitochondrial membrane potential

2013-09-09

國家自然科學基金項目（31071922）, 河南省重點科技攻關計劃項目（112102310325）, 河南工業(yè)大學科學研究基金研究生教育創(chuàng)新計劃項目（12YJCX51）

閻曉慧，女，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學; E-mail：879153058@qq.com

李瑞芳，女，博士，教授，研究方向：微生物與生化藥學; E-mail：lrf@haut.edu.cn